15.9 : Изоляция ДНК

Клеточная ДНК требуется для многих биотехнологий и научно-исследовательских задач, таких как молекулярное клонирование. Для удаления и очистки ДНК из клеток исследователи используют различные методы извлечения ДНК. Хотя специфика различных протоколов может варьироваться, некоторые общие понятия лежат в основе процесса извлечения ДНК.

Процесс

Во-первых, клетки необходимо лизировать— и вскрыть—, чтобы ДНК выпала в раствор. Клетки можно физически лизировать с использованием оборудования, такого как гомогенизатор, ультразвуковой аппарат или устройство для взбивания шариков, которое измельчает или иным образом прикладывает силу для разрушения клеток. Часто во время лизиса добавляют такие вещества, как детергент, чтобы химически разрушить липидные клеточные мембраны, помогая высвободить ДНК из ядра и клетки. Вращение в центрифуге осаждает клеточный мусор на дно, а клеточный материал, содержащий лизат, собирается для дальнейшей обработки.

Затем ДНК необходимо отделить от других клеточных молекул, таких как РНК и белки. Следовательно, ферменты, такие как РНКаза и протеиназа К, часто добавляют во время или после лизиса для разрушения РНК и белков соответственно. Кроме того, для отделения ДНК от белка обычно используются органические растворители, такие как фенол и хлороформ. Обычно образец встряхивают с фенол-хлороформом и затем центрифугируют для разделения водной и органической фаз в пробирке. Затем ДНК-содержащую водную фазу в верхней части можно отбросить, оставив белок в органической фазе.

Во время экстракции ДНК часто добавляют соли, чтобы стабилизировать ДНК и помочь выпустить ее из раствора. Стандартный метод преципитации ДНК заключается в добавлении к образцу ледяного спирта, такого как этанол или изопропанол. В результате ДНК в жидкости в пробирке образует белый мутный осадок.

Затем образец вращается в центрифуге, в результате чего осадок ДНК собирается на дне пробирки в виде осадка. Гранулы промывают, удаляя жидкость, промывая спиртом и снова отжимая. После последней промывки осадок повторно суспендируют в буфере & mdash; создавая водный раствор очищенной ДНК, готовый к изучению или использованию в биотехнологии.