Nosso objetivo é desenvolver e caracterizar um modelo baseado em organoides para imitar o trato gastrointestinal e compará-lo com porcos vivos, e focar nas características de transporte. A mudança de um experimento animal clássico para. Em nosso campo da fisiologia gastrointestinal para um.
Modelo in vitro baseado em organoide, que imita a situação in vivo. Combinamos nosso modelo do intestino delgado e grosso de organoides com. Que pode ser usado para investigar as características de transporte em tempo real para permitir uma comparação do nosso modelo e da situação do porco vivo.
Especialmente no campo da pesquisa relacionada à pecuária, modelos alternativos aos experimentos clássicos com animais são raros. Superamos essa limitação usando nosso modelo baseado em organoides do trato intestinal suíno. Planejamos usar nosso modelo intestinal baseado em organoides para estudar os efeitos das bactérias patogênicas suínas.
O objetivo é entender os mecanismos de patogenicidade dessas bactérias. Para começar, misture a membrana basal recém-descongelada na proporção de 1:40 com PBS estéril gelado em um tubo cônico. Adicione 200 microlitros desta mistura ao compartimento apical de cada inserção dentro das placas estéreis.
Recoloque a tampa da placa do poço e incube por pelo menos 1.5 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, aspire cuidadosamente a solução sem tocar na membrana. Remova o meio organoide dos poços contendo organoides tridimensionais da cripta.
Para dissolver a membrana basal, adicione um mililitro de PBS gelado ao poço e pipete para cima e para baixo com uma ponta P1000. Colete todos os organoides dissolvidos em um tubo de 15 mililitros pré-preenchido com 10 mililitros de PBS gelado. Centrifugue o tubo a 250 G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em um mililitro de EDTA quente a 0,05% de tripsina. Incube o tubo por cinco minutos a 37 graus Celsius em banho-maria e, em seguida, coloque-o no gelo para interromper a reação. Com uma ponta P1000, pipete para cima e para baixo 20 vezes para ressuspender completamente os organoides e, em seguida, repita por mais 15 vezes usando uma ponta P1000 com uma ponta P200 presa na parte superior.
Agora, adicione 10 mililitros de DMEM gelado suplementado com 10% de soro fetal de bezerro, ou FCS. Centrifugue o tubo a 1000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em um mililitro de meio monocamada.
Usando uma câmara de Neubauer, siga as instruções do fabricante para determinar o número de células vivas por mililitro. Agora, substitua a solução de revestimento do compartimento apical por 500 microlitros do meio monocamada, temperado a 37 graus Celsius, e adicione três mililitros do meio monocamada ao compartimento lateral basal. Remova o meio monocamada apical.
Para cultura 2D, adicione 500 microlitros de meio monocamada contendo uma quantidade adequada de células à câmara apical de cada transwell e incube as células. Para resistência elétrica transepitelial, ou medição TEAR, limpe o eletrodo do pauzinho com etanol a 70% e deixe secar completamente. Introduza o braço curto do eletrodo do pauzinho no compartimento apical e o braço longo no compartimento lateral basal das inserções.
Em seguida, ligue e deixe o. Medidor equilibrado para uma medição estável e, em seguida, clique no botão armazenar para registrar os valores TEAR. Depois de medir o último poço, clique em salvar para armazenar dados em um dispositivo USB.
Limpe o eletrodo após cada placa e no final da medição. Deixe o eletrodo secar completamente antes de armazená-lo. Subtraia os valores TEAR em branco determinados antes de semear as células dos valores celulares medidos.
Troque o meio e meça o TEAR a cada dois ou três dias, garantindo que o TEAR seja medido antes que o meio seja trocado. Adicione cuidadosamente 500 microlitros, ou três mililitros, de meio de diferenciação fresco e quente aos compartimentos apicais e basais. No dia 18 para organoides jejunais, ou no nono dia para organoides colônicos, após a semeadura, prossiga com experimentos funcionais.
Aqueça as soluções tampão mucosas e serosais a 37 graus Celsius e areje com carbogênio. Monte as câmaras individuais usando um inserto vazio para cada câmara individual, garantindo que os lados apicais dos poços transcais estejam todos voltados para a mesma direção. Encha todas as câmaras com cinco mililitros de solução tampão mucosa pré-aquecida.
Conecte todos os eletrodos do grampo de tensão às câmaras individuais seguindo as instruções do fabricante. Para calibrar o software da câmara de Ussing, clique no botão RFDPI no software de grampo de tensão. Confirme se a resistência de todas as pastilhas vazias é de aproximadamente 70 ohms e a corrente é de cerca de zero milivolts.
Remova todos os eletrodos e descarte a solução tampão usada. Abra as câmaras individuais, remova as inserções vazias e mantenha a ordem das câmaras. Agora, sob o gabinete de segurança, aspire cuidadosamente o meio basolateral e apical da placa.
Lave as células com 500 microlitros de tampão mucoso quente na câmara apical e com três mililitros de tampão seroso na câmara basolateral. Remova as inserções da placa e remova cuidadosamente seus suportes. Coloque os insertos nas câmaras de Ussing, garantindo que a orientação corresponda à fase de calibração.
Depois de montar as câmaras individuais, encha as câmaras voltadas para o lado basolateral das células com cinco mililitros de tampão seroso e as voltadas para o lado apical com cinco mililitros de tampão mucoso. Conecte os eletrodos e tubos de aeração a cada câmara individual e inicie a medição no software Ussing. Altere as condições do modo de circuito aberto para o modo de curto-circuito no software.
Após cinco a 10 minutos de equilíbrio, adicione 10 forscolina micromolar à câmara serosa. Após 15 minutos, pare a medição, remova os tubos de aeração e eletrodos das câmaras e desmonte as câmaras. Os valores de resistência elétrica transepitelial aumentaram progressivamente durante o cultivo, atingindo um pico de 150 ohms vezes centímetro quadrado para jejuno após 18 dias e 200 ohms centímetro quadrado para organoides de cólon após nove dias.
Os valores basais de corrente de curto-circuito foram significativamente menores nos organoides do jejuno do que nos organoides do cólon, enquanto os valores de resistência basal não mostraram diferenças significativas. Os tratamentos com forscolina aumentaram significativamente os valores basais de corrente de curto-circuito em organoides jejunais de 0,86 para 27,78 microamperes por centímetro quadrado e em organoides colônicos de 3,83 para 28,78 microamperes por centímetro quadrado.
