Este estudo introduziu uma manipulação cirúrgica para expor o DRG torácico em camundongos anestesiados para imagens de cálcio in vivo junto com o registro de eletrocardiograma sincronizado. Ao fazer isso, tentamos responder se a acupuntura no PC6 no forame poderia ativar o neurônio DRG e simultaneamente regular o eletrocardiograma. As técnicas atualmente usadas em estudos de acupuntura incluem eletrofisiologia in vivo ou vitro, rastreamento neural e várias estratégias combinadas com optogenética e quimiogenética.
A imagem de cálcio in vivo introduzida neste estudo ajuda a entender melhor as atividades das populações de neurônios DRG induzidas pela acupuntura, todas em diferentes modelos animais, por meio de registros dinâmicos e em tempo real. Devido à curvatura fisiológica da coluna torácica em um a cinco segmentos vertebrais torácicos, os DRGs torácicos são bastante difíceis de expor. Além disso, as influências dos ritmos cardíaco e pulmonar fazem com que a fixação dos DRGs torácicos seja desafiadora.
Caso contrário, a anestesia respiratória e a manutenção da condição dos camundongos por horas não são fáceis. A imagem de cálcio in vivo revela a atividade de populações específicas de neurônios usando camundongos de engenharia genética. Esta é a primeira vez que os neurônios DRG torácicos foram observados in vivo.
Essa abordagem realiza a observação das atividades neuronais produzidas por estímulos somáticos ou viscerais, bem como sua diafonia. Nosso laboratório estabeleceu métodos para imagens de cálcio in vivo de DRG torácico e lombar e, no futuro, revisaremos os receptores relacionados aos fatores iniciadores da acupuntura, hipersensibilidade dos acupontos, interações entre estimulação da acupuntura somática e entradas viscerais. Depois de realizar uma traqueotomia em um camundongo anestesiado, coloque-o em decúbito ventral em uma almofada aquecida.
Faça uma incisão longitudinal de dois centímetros no centro da nuca, estendendo-se das seis vértebras cervicais às três vértebras torácicas. Separe cuidadosamente as glândulas gordurosas e hibernantes na face anterior das vértebras torácicas do camundongo, evitando os vasos sanguíneos abaixo das glândulas. Use uma tesoura de mola para cortar a pele e as camadas musculares, incluindo o músculo trapézio.
Insira um afastador entre os músculos para ajudar na exposição adicional. Remova os músculos que se ligam ao grampo da cabeça e a porção reta dos músculos longos do pescoço, expondo os processos espinhosos dos dois torácicos. Desloque os músculos semiespinhal e espinhal para expor o arco vertebral de C6 a T3. Corte a conexão entre a placa do arco vertebral e o processo articular da torácica.
Use uma pinça fina para remover meticulosamente os processos articulares esquerdo e direito e os processos mamilares do torácico. Limpe o tecido conjuntivo sobrejacente. Exponha cuidadosamente o gânglio da raiz dorsal torácica esquerda ou direita, ou DRG, garantindo a integridade do epineuro no lado escolhido.
Coloque uma pequena bola de algodão embebida em solução salina morna sobre o DRG exposto para manter a umidade. Conecte o monitor de ECG com o pólo negativo no membro superior direito, o fio terra no membro inferior direito e o pólo positivo no membro inferior esquerdo. Coloque o mouse no palco da braçadeira espinhal personalizada com uma almofada de aquecimento.
Prenda o mouse usando dois clipes presos aos processos articulares de seis cervicais e três torácicos. Posicione o grampo espinhal com o mouse preso sob o microscópio confocal. Coloque a objetiva de ar de longa distância de trabalho de 10x/0.32 sobre o 1 DRG torácico exposto.
Defina o tamanho da etapa para 25 micrômetros e uma resolução de 512 por 512 ou 1.024 por 1.024 pixels. Ajuste o eixo z do estágio para cima e para baixo e capture todo o 1 DRG torácico. Aplique estimulação com escova no membro superior do camundongo e avalie a capacidade de resposta dos neurônios DRG imageados.
Realize estimulações de nervos periféricos na estimulação PC6 usando um estimulador. Em condições basais, a maioria dos neurônios no 1 DRG torácico não exibiu fluorescência GFP. A estimulação somática resultou em um aumento rápido e transitório na fluorescência do GCaMP com um aumento no número e intensidade da GFP.
As estimulações dos nervos periféricos na aplicação do PC6 resultaram em alterações semelhantes na fluorescência do GCaMP como a estimulação somática. Os neurônios foram marcados e numerados em um único 1 DRG torácico após rastreamento com software de imagem. Neurônios que apresentaram alterações na intensidade de fluorescência superiores a 130% do limiar F0 foram considerados respostas positivas.
O histograma exibiu os diferentes diâmetros dos neurônios responsivos às estimulações dos nervos periféricos no PC6. As estimulações dos nervos periféricos na estimulação PC6 mostraram aumento da frequência cardíaca.
