Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Estudamos a dinâmica de movimento de diferentes componentes do replissoma eucariótico no nível de uma única molécula. A fim de obter uma compreensão quantitativa profunda de como as células podem duplicar seus genomas inteiros, a cada ciclo celular. Em um avanço em 2015, a replicação do DNA eucariótico foi totalmente reconstituída in vitro a partir de componentes proteicos purificados.

E isso nos deu muito controle sobre o sistema. E desde então, tem sido usado extensivamente para responder a perguntas sobre diferentes estágios de replicação do DNA com o aumento da resolução temporal e espacial. E isso foi feito usando abordagens complementares, como crio EM e biofísica de molécula única.

No campo de molécula única, um dos maiores desafios com este sistema é o número de proteínas envolvidas e também as concentrações nas quais esses componentes são necessários para maximizar a eficiência da reação geral, pois isso pode complicar a imagem de molécula única. O protocolo descrito aqui apresenta uma abordagem híbrida na qual um complexo de proteínas é primeiro montado de maneira eficiente usando bioquímica de conjunto antes de ser introduzido e estudado em um único ambiente de molécula. Isso evita a introdução de duas altas concentrações de proteína no nível de uma única molécula.

Ilustramos essa abordagem para estudar o comportamento da helicase replicativa CMG no DNA no nível de molécula única após sua montagem por meio da via baseada na origem. Mas essa abordagem também pode ser usada para estudar a dinâmica de muitos outros tipos de complexos de proteínas de ligação ao DNA.