Este protocolo apresenta o Sistema de Ativação CRISPR do SPH como uma estratégia alternativa aos vetores virais convencionais para realizar ensaios de ganho de função em adipócitos. Ele permite a superexpressão de genes endógenos de adipócitos únicos ou múltiplos dentro do ambiente celular complexo do tecido adiposo, entregando um RNA guia único personalizado usando um vírus adeno associado. As etapas desafiadoras deste protocolo estão relacionadas à clonagem do RNA-guia único e à produção e injeção de vírus adenoassociados no tecido adiposo.
Para começar, projete RNA guia único ou sgRNA para ativação CRISPR usando chopchop ou qualquer outra ferramenta adequada. Projetar o sgRNA visando o gene PRDM16 usando os seguintes parâmetros:Alvo como PRDM16 em um músculo Mus usando um CRISPR/Cas9 e para como ativação. Adicione saliências ao sgRNA para corresponder ao local de restrição Sac1 na espinha dorsal vetorial PAAVU6GRNACBHM cereja.
Incluir 5'AGCT 3'onde n corresponde a nucleotídeos. Obter sequência de complemento reverso de 3'sgRNA usando a ferramenta indicada. Em seguida, para o recozimento de oligonucleotídeos de fita simples, adicionar um microlitro de cada oligonucleotídeo de fita simples de 5' e 3', um microlitro de tampão ligase T4, 0,5 microlitros de polinucleotídeo quinase T4 e 6,5 microlitros de água para um volume final de reação de 10 microlitros.
Recozinhe os oligonucleotídeos de fita simples usando um termociclador a 37 graus Celsius por 30 minutos e 95 graus Celsius por cinco minutos, seguido por uma taxa de ramp-down de cinco graus Celsius por minuto. Em seguida, para a ligadura dos oligonucleotídeos de sgRNA recozidos, adicione 25 nanogramas de plasmídeo PAAVU6GRNACBHM cereja a dois microlitros de oligonucleotídeos de sgRNA recozidos, um microlitro de enzima Sac1, dois microlitros de tampão de ligase de DNA 10X T4, um microlitro de DNA ligase T4 e água para um volume final de reação de 10 microlitros. Usando um termociclador, realize a ligadura incubando a mistura de reação por 15 ciclos a 37 graus Celsius por cinco minutos e 25 graus Celsius por cinco minutos, seguidos de manutenção a quatro graus Celsius.
Em seguida, transformar as competentes células de Escherichia coli DH10B com quatro microlitros do produto da ligadura por choque térmico a 42 graus Celsius por 45 segundos e espalhar em uma placa de ágar contendo 10 microgramas por mililitro de ampicilina. Confirme colônias transformadas por Reação em Cadeia da Polimerase de Colônia ou PCR usando o PCR Master Mix, escolha a colônia e misture-a com cinco microlitros de Master Mix, 0,1 microlitros de primer universal universal, 0,1 microlitro de primer reverso de sgRNA e cinco microlitros de água. Execute o PCR usando desnaturação inicial a 94 graus Celsius por dois minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94 graus Celsius por 20 segundos, recozimento por 30 segundos a 60 graus Celsius, extensão a 72 graus Celsius por 30 segundos e uma etapa final de alongamento a 72 graus Celsius por cinco minutos.
Após a PCR, resolver o DNA usando eletroforese em gel de agarose em tampão TAE 0,5X a 90 volts por 30 minutos. Envie amostras positivas para o Sequenciamento de Sanger usando primer universal. Em seguida, purifice o plasmídeo de um clone positivo usando um kit de purificação de plasmídios seguindo as instruções do fabricante.
Coloque o camundongo anestesiado na posição supina e raspe uma pequena área nos flancos proximais às articulações do quadril para injeções de tecido adiposo branco inguinal ou IWAT com um barbeador. Adicione o creme depilatório por cinco minutos. Retire o creme residual com água para evitar queimaduras na pele.
Desinfetar a pele usando três rodadas alternadas de aplicação da solução de iodopovidona sobre a pele com gaze limpa e álcool a 70%. Em seguida, faça uma incisão de um a dois centímetros com tesoura esterilizada na área proximal das articulações e mantenha a pele aberta usando pinças para expor o depósito de gordura. O WAT pode ser anexado à pele em ambos os lados, estendendo-o desde o início a partir das costas e em direção aos testículos.
Usando pinças, puxe suavemente o depósito de gordura para cima através da incisão para garantir que a injeção esteja no local e na profundidade corretos. Encha a seringa de microlitros com 2,5 microlitros do vírus adenoassociado ou um AAV contendo o sgRNA direcionado ao gene endógeno PRDM16. Introduza cuidadosamente a agulha num ângulo de 30-45 graus no IWAT.
Repita a injeção cinco vezes em diferentes locais do tecido para infectar homogeneamente todo o coxim gorduroso IWAT. Coloque o mouse na almofada de aquecimento até que a consciência seja recuperada. Monitorar o animal a cada 10 a 15 minutos até que ele se recupere totalmente.
Após o animal recuperar a consciência, observe o perfil da locomotiva, que deve ser linear e não apresentar sinais de angústia ou dor. Veja as células vasculares estromais ou SVF's derivadas do IWAT de camundongo SPH adiposo em uma placa de 6 poços contendo meio DMEM completo por uma a duas horas, aspirar o meio, lavar o poço duas vezes usando PBS e substituí-lo por meio fresco e completo. Incubar as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade até que as células atinjam 70-80% de confluência.
No Dia 0, induzir a diferenciação tratando as células com o meio de indução e após dois dias substituir o meio de indução pelo meio de manutenção. Novamente após dois dias, no quarto dia, substitua o meio de manutenção por um novo meio de manutenção por 2-3 dias. Troque o meio de manutenção a cada 48 horas até que os pré-adipócitos sejam totalmente diferenciados em adipócitos.
Observe os adipócitos maduros usando microscopia de luz, pois as células diferenciadas parecem estar carregadas de gotículas lipídicas. Depois de crescer as células em uma placa de cultura de 6 poços com o meio completo até que as células atinjam 70-80% de confluência, misture 5,6*10^10 genoma viral por microlitro de sgRNA PRDM16 carreador de AAV com dois mililitros de meio completo e brometo de hexadimetrina. Transduzir as células substituindo o meio completo e adicionando o meio completo contendo AAV.
Incubar as células transduzidas por 12 horas a 37 graus Celsius, 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono. Dividir e ver as células como descrito para proliferação celular e diferenciação em adipócitos bege. As imagens de imunofluorescência do IWAT de camundongos adiposos com HPS demonstraram a expressão de dCas9 nos grupos controle e PRDM16.
A expressão de PRDM16 induzida por SPH induziu claramente um acúmulo generalizado de adipócitos beges multioculares no IWAT. Além disso, a PCR quantitativa revelou um aumento da expressão de PRDM16 e do programa de genes termogênicos no grupo PRDM16 em comparação com o controle. Da mesma forma, a análise in vitro da expressão gênica confirmou o aumento da expressão do gene endógeno PRDM16 e genes termogênicos no grupo de superexpressão de PRDM16 em comparação com o controle.
A expressão de PRDM16 induzida por SPH resultou em maior consumo basal e máximo de oxigênio do que nas células controle. É importante ressaltar que os dados indicaram maior respiração não acoplada no grupo PRDM16 em comparação com o grupo controle. O modelo de SPH adiposo é adequado para investigar múltiplos genes e elementos regulatórios dentro de adipócitos.
Este método abre a possibilidade de uma compreensão mais profunda da biologia da gordura bege.
