Este método oferece uma maneira de amplificar o sinal de eventos de ligação em uma forma que é detectável visualmente para baixo uso de recursos ou pode ser quantificada usando instrumentação baseada em absorbância. Este é um protocolo relativamente rápido, one-pot para determinar a presença do alvo do aptâmero em uma amostra de interesse. Os resultados podem ser comparados com uma curva de calibração padrão se a quantificação for desejada.
Os indivíduos devem ser muito precisos ao transferir e misturar as soluções, pois a mistura insuficiente levará a resultados negativos. Além disso, certifique-se de que os reagentes e soluções sejam mantidos refrigerados até o uso para minimizar o sinal de fundo. Comece ativando os produtos de clivagem da ribozima adicionando cinco unidades de polinucleotídeo quinase T4 em um tubo de PCR.
Em seguida, adicione um microlitro de tampão de ribozima 5X pré-preparado a cada tubo de amostra. Para demonstrar visualmente a especificidade, adicione 1,5 microlitros de teofilina milimolar ou cafeína milimolar a cada tubo de amostra como amostras de teste e misture cada amostra completamente pipetando cinco a 10 vezes. Em seguida, adicione dois microlitros de RNA nanomolar 600 contendo um domínio aptamérico alvo-específico a cada tubo de amostra, seguido de pipetagem para misturar os componentes rapidamente.
Agora, coloque o tubo em um bloco frio para minimizar o sinal de fundo. Depois de preparar todos os tubos de reação, incubar cada amostra à temperatura ambiente por precisamente três minutos. No final da incubação, devolva os tubos de amostra ao gelo imediatamente.
Adicione 3,5 microlitros de mistura enzimática nicase polimerase a cada tubo de amostra e misture bem. Em seguida, adicionar 31,5 microlitros de mistura de reação EXPAR contendo nucleotídeos molde e tampão de reação a cada tubo de amostra e misturar por pipetagem. Depois que todas as amostras estiverem preparadas, incube a amostra preparada a 55 graus Celsius por cinco minutos usando um temporizador.
Devolver imediatamente os tubos de amostra ao gelo após a incubação. Adicione dois microlitros de solução de hemina a cada tubo de amostra para o desenvolvimento da cor e misture bem. Em seguida, adicione 58 microlitros da solução de TMB comercialmente disponível a cada tubo de amostra, misture bem e incube para o desenvolvimento de cores.
Leia as amostras qualitativamente a olho perdido ou quantifique os resultados usando um leitor de placas de absorbância, conforme descrito no manuscrito. A construção otimizada foi capaz de reconhecer apenas 500 teofilina nanomolar em 30 minutos. As preparações de amostra expostas ao alvo produzem uma cor azul, enquanto as amostras que não contêm nenhum alvo permanecem incolores.
Uma curva padrão foi preparada a partir do sinal medido em A450 após 30 minutos de desenvolvimento da cor. É importante manter as amostras no gelo quando não estiver realizando incubações, pois mesmo o RNA otimizado ainda exibirá um baixo nível de atividade de fundo.
