Um sério obstáculo para o tratamento do câncer é o acesso limitado da terapêutica a células tumorais mais profundas devido a barreiras fisiológicas. Assim, o desenvolvimento de novos transportadores moleculares capazes de tratar barreiras biológicas é fortemente desejado para aumentar a eficiência da liberação de fármacos. O objetivo deste procedimento é sintetizar os peptídeos cíclicos penetrantes em células para maior penetração célula-a-célula.
A vantagem deste método é que a ciclização peptídica pode ser facilmente conseguida através de reações de substituição por cisteínas e resina sem a necessidade de catalisadores metálicos. A incorporação de ligações cruzadas aromáticas melhora a hidrofobicidade global dos peptídeos em comparação com as ligações cruzadas hidrofílicas lactâmicas ou triazólicas, aumentando assim sua permeabilidade. Para começar, monte o aparelho manual de síntese de peptídeos no exaustor.
Coloque as torneiras de três vias no coletor de vácuo e conecte-as ao nitrogênio. Certifique-se de tampar as entradas não utilizadas. Fixe uma coluna de polipropileno de 10 mililitros nas torneiras de três vias e escorra a mistura de reacção ou solventes da coluna de polipropileno utilizando um bulbo de pipeta de borracha ou um vácuo através de uma armadilha de resíduos.
Para preparar a resina para síntese peptídica, adicione 4 a 5 mililitros de DMF à quantidade necessária de resina e transfira-a para a coluna de polipropileno com borbulhamento suave de nitrogênio por 30 minutos para inchar a resina adequadamente. Escorra o CPO e adicione 4 a 5 mililitros de 50% de morfolina/DMF à resina. Borbulhar suavemente o azoto durante 30 minutos para remover o grupo Fmoc N-terminal e, em seguida, escorra a mistura.
Lave bem a resina três vezes, adicionando 4 a 5 mililitros de DMF à coluna e borbulhando com nitrogênio por pelo menos 1 minuto de cada vez. Da mesma forma, lavar a resina com diclorometano três vezes e DMF três vezes. Em seguida, dissolva 648,8 miligramas de arginina protegida por Fmoc e PBF e 372,6 miligramas de HATU em 5 mililitros de DMF em um tubo de centrífuga.
Adicionar 348,4 microlitros de DIPEA para ativar a reação de acoplamento e transferir a mistura de reação para a coluna de polipropileno com resina. Agite suavemente a mistura com borbulhamento de nitrogênio por 1 a 2 horas e, em seguida, repita a reação de acoplamento uma vez. Escorra a mistura de reação e lave a resina sequencialmente com DMF, diclorometano e novamente DMF três vezes cada por pelo menos 1 minuto cada vez.
Remova o grupo protetor Fmoc e lave a resina seguindo o procedimento mostrado anteriormente antes de proceder ao acoplamento do próximo aminoácido. Em seguida, acople a beta-alanina como um espaçador para marcação de FITC usando o mesmo processo mostrado para acoplamento de aminoácidos e, em seguida, adicione uma mistura de FITC, DIPEA e DMF à coluna de polipropileno no escuro para realizar a marcação FITC de peptídeos na resina. A reação levaria quase 8 horas.
Para realizar a ciclização do peptídeo linear, adicione uma mistura de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano e diclorometano à coluna de polipropileno por 2 minutos para remover seletivamente o grupo tritilprotetor da cisteína. Escorra a mistura e repita o procedimento até que a solução amarelada se torne incolor para remover completamente o grupo protetor de tritil. Realizar lavagens sequenciais da resina com DMF e diclorometano pelo menos três vezes e dissolver 4,4'bis-bromometil-bifenil em DMF com DIPEA.
Adicione a solução à coluna e reaja durante 4 horas. Lave a resina com 4 a 5 mililitros de metanol duas vezes por cinco minutos cada, e seque-a com um fluxo contínuo de nitrogênio. Para peptídeos contendo cisteínas, tratar a resina com um coquetel de clivagem eficaz de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano e água ou ácido trifluoroacético, triisopropilsilano, 1, 2-etanedithiol e água.
Trate a resina ligada ao peptídeo por 2 a 3 horas para clivar o peptídeo e, em seguida, remova o ácido trifluoroacético cuidadosamente com uma corrente de nitrogênio. Para obter os peptídeos brutos, adicione 4 a 5 mililitros de éter dietílico à preparação peptídica clivada para precipitar os peptídeos brutos e centrifugar a 10.000 x g por 4 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e seque o peptídeo ao ar por 3 minutos em uma exaustora eficaz.
Dissolva o peptídeo bruto em pequena escala em 800 microlitros de acetonitrila e, em seguida, analise-o usando cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa e cromatografia líquida-espectrometria de massas. Inocular 100.000 células HeLa em 2 mililitros de DMEM em uma câmara de 12 poços com uma inserção de placa de cultura de tecido e incubar por 24 horas em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius contendo 5% de dióxido de carbono. Remover o meio e incubar as células nas câmaras com 1 mililitro de 10 micromolares FITC-R8 ou FITC-sR8-4 em DMEM livre de FBS por 1 hora.
Depois disso, remova o meio que contém os peptídeos e lave as células três vezes com 1 mililitro de PBS. Adicione 1 mililitro de DMEM fresco livre de FBS às câmaras e, em seguida, co-incube as células HeLa na câmara com a inserção da placa de cultura de tecido, com as células HeLa nas lamínulas redondas na parte inferior por 2 horas. Fixar as células HeLa nas lamínulas redondas com glutaraldeído a 2,5% durante 15 minutos e, em seguida, corar as células com DAPI durante 15 minutos.
Finalmente, observe as células HeLa nas lamínulas sob um microscópio de fluorescência. Um diagrama esquemático da síntese do peptídeo R8 linear marcado com FITC e do peptídeo R8 grampeado marcado com FITC é apresentado aqui. Os espectros de HPLC e MS do peptídeo linear R8 e do peptídeo R8 grampeado são mostrados nesta figura.
O tempo de retenção do peptídeo grampeado foi substancialmente maior do que o do análogo linear, indicando uma maior hidrofobicidade global do peptídeo após a ciclização com a reticulação hidrofóbica. Esta imagem gráfica representa a estabilidade do peptídeo linear e do peptídeo grampeado na presença de 25% FBS. O R8 cíclico permanece 77,3% intacto após incubação com FBS por 4 horas, enquanto sua contraparte linear foi degradada em sua maioria, sugerindo maior estabilidade proteolítica do peptídeo R8 cíclico.
Imagens de microscopia de fluorescência de células vivas de células HeLa e células 4T1 após 1 hora de incubação com 3 peptídeo R8 linear marcado com FITC e peptídeo R8 grampeado marcado com FITC são mostradas aqui. Pode-se observar que as células tratadas com R8 cíclico com reticulação aromática exibiram maior fluorescência intracelular do que aquelas tratadas com sua contraparte linear. Resultados semelhantes foram obtidos com a análise por citometria de fluxo.
Para investigar melhor se o R8 cíclico confere maior penetração célula-a-célula, modelos transwell foram usados para simular a permeabilidade de barreira dos peptídeos de uma camada celular para outra. O R8 cíclico exibiu claramente maior penetração de transbarreira do que o peptídeo linear R8, como indicado por um aumento significativo na fluorescência intracelular. A desproteção completa do grupo tritilo cisteína e resina é importante para a etapa seguinte de ciclização.
Além disso, a eficiência da ciclização também depende das sequências específicas e dos comprimentos dos peptídeos devido aos efeitos estéricos. Nesse caso, o uso de uma resina com menor capacidade de carga ou ciclização dos peptídeos sob concentrações diluídas em fase de solução seria útil. Esses peptídeos cíclicos mostraram uma permeabilidade célula-célula aumentada em comparação com suas contrapartes lineares.
Acreditamos que eles são uma grande promessa para vencer barreiras biológicas e serão usados para uma base molecular para futuras aplicações no campo da liberação de fármacos.
