Este protocolo testa a eficácia de desinfecção da lavagem de água quente. Pode ajudar a avaliar se uma lavadora e secadora são adequadas para limpar roupas contaminadas por um vírus. A principal vantagem dessa técnica de lavagem é que ela pode ser replicada em outros laboratórios em menor escala usando procedimentos que passaram pelo processo de garantia de qualidade.
Demonstrando o procedimento estarão Ahmed Abdel-Hady, um microbiologista, Mariela Monge e Jonathan Sawyer, cientistas de pesquisa e outros do nosso laboratório. Para começar, prepare o ágar tríptico de soja modificado pesando e misturando os ingredientes em água deionizada, conforme descrito no texto. Em seguida, adicione um mililitro de alíquota Phi6 concentrada não diluída ao ágar macio e 100 microlitros de uma cultura de pseudomonas syringae de fase logarítmica.
Em seguida, despeje ágar macio na superfície de uma placa de ágar de soja tríptica modificada solidificada com um diâmetro de 100 milímetros. Evite bolhas ou derramamento girando as placas suavemente e distribuindo o ágar macio uniformemente sobre a superfície sólida do ágar. Após a incubação durante a noite à temperatura ambiente, raspe suavemente o conteúdo das três placas com um espalhador de células estéreis em um tubo crônico estéril de 50 mililitros contendo 15 mililitros de tampão SM.
Vórtice os tubos na configuração máxima por um a dois minutos para quebrar o ágar e, em seguida, centrifuga-os por 15 minutos a 7.000 vezes G.Em seguida, colete o sobrenadante e filtre-o através de um filtro de seringa de 0,2 mícron. Armazenar o sobrenadante filtrado como alíquotas de um mililitro em criovios a 80 graus Celsius até novo uso. Realizar a avaliação visual pré-teste, medindo e registrando o comprimento e a largura dos equipamentos de proteção individual não lavados ou itens de EPI em vários locais.
Para a inoculação, preparar uma solução de extrato de carne bovina a 10%, dissolvendo um grama de extrato de carne bovina em um volume total de 10 mililitros de 1X PBS. O filtro esteriliza todo o volume da solução utilizando um filtro de seringa de 0,2 mícron. Em seguida, dentro do gabinete de biossegurança, inocular os cupons de teste e controle positivo com aproximadamente 10 a sétima placa formando unidades por amostra, pipetando uma quantidade de 10 microlitros da solução no item de EPI como múltiplas gotículas e espalhando a gota usando a ponta da pipeta.
Aqueça a solução de lavagem a 50 graus Celsius usando uma placa quente e agite a barra. Em seguida, meça e registre o pH e a temperatura da solução de lavagem e colete 10 mililitros de solução para verificação da esterilidade. Em seguida, despeje 3,25 litros de solução de lavagem em uma lavadora esterilizada.
Coloque itens de EPI, uma cobertura facial inoculada e quatro máscaras de filme não contaminadas sem cupons na lavadora. Depois de lavar os itens de EPI por 18 minutos, escorra a lavadora e triplifique o enxágue com cinco litros de água da torneira à temperatura ambiente de cada vez para remover a espuma. Adicione 3,25 litros de água da torneira esterilizada à temperatura ambiente na lavadora e realize um ciclo de enxágue de nove minutos de duração.
Em seguida, mova os itens de EPI para o lado giratório da lavadora para girar por cinco minutos. Seque os itens de EPI por 80 minutos na configuração de calor elevado de 93 graus Celsius no secador. Em seguida, mova os itens de EPI do secador para o espaço de trabalho estéril.
Remova assepticamente os cupons dos itens inoculados e coloque-os em tubos cônicos. Em seguida, extraia os cupons em 10 mililitros de caldo neutralizante 10%Dey-Engley por vórtice por dois minutos na configuração máxima do equipamento. Para chapear os extractos utilizando um método convencional de sobreposição de ágar de tampa mole, adicionar alíquotas de amostra de ensaio ao tubo de ágar macio contendo seis mililitros de ágar macio e 100 microlitros das seringas P da fase logar.
Em seguida, despeje o ágar macio na superfície de uma placa de ágar de soja tríptica modificada solidificada e distribua uniformemente o ágar macio sobre a superfície do ágar sólido girando a placa. Após a incubação durante a noite à temperatura ambiente, enumere manualmente as unidades de plataforma em cada placa. Os testes laboratoriais sistemáticos para avaliar a eficácia de lavagem da desinfecção viral a partir de EPIs ou roupas de tamanho normal, mostraram que a unidade de plataforma ou contagem de placas de PFU e o volume de amostra extraído permitiram o cálculo do número de unidades de plataforma por cupom de teste.
Os resultados da recuperação viral representativa foram obtidos para um teste de cobertura facial. Os testes de lavagem forneceram informações sobre as propriedades do material, como o alongamento ou encolhimento dos itens de vestuário e dados de qualidade controlada do protocolo. A eficácia da lavagem de água quente na desinfecção de coberturas faciais, denim e materiais de EPI de esfoliação de Phi6 foi demonstrada neste gráfico onde as estrelas denotam a desinfecção completa.
É importante usar técnicas assépticas durante todo este procedimento para evitar a contaminação cruzada. Além disso, os tempos de secagem de inóculo para cupons são exclusivos para cada material e são estabelecidos antes do teste. Outros métodos complementares incluem testes de microscopia e penetração de líquidos para explorar a degradação do material ou avaliações de tamanho adicionais, garantindo que a proteção da barreira ainda se encaixe no usuário.
Essa técnica forneceu a base para ampliar a eficácia da lavagem e os testes de material para roupas e itens de EPI em grande escala. Também pode ajudar a estabelecer procedimentos eficazes de lavagem durante outro evento de contágio ou pandemia.
