O conhecimento da biodisponibilidade de ferro é essencial para a avaliação da qualidade nutricional do ferro nos alimentos. O bioensaio celular Caco-2 foi desenvolvido para atender a essa necessidade crítica de pesquisa. Este bioensaio é uma abordagem econômica e de alto rendimento para determinar a biodisponibilidade de ferro de diferentes dietas.
Pode ser usado para caracterizar fatores que influenciam a biodisponibilidade de ferro e o refino in vivo objetivos do estudo. Demonstrando o procedimento estará Yongpei Chang, um técnico de pesquisa do meu laboratório. Para começar, cultura as células Caco-2 por 7 a 10 dias, e uma vez que células suficientes estão disponíveis as células em um frasco não revestido de colágeno.
Em seguida, cresça as células em frascos por sete dias e mude o meio em um dia alternativo. No sétimo dia use as células para semear as placas multi-poços. Semente as células Caco-2 a uma densidade de 50.000 células por centímetro quadrado em seis placas bem revestidas de colágeno.
Adicionar DMEM suplementado com HEPES, FBS e solução antimíctica 1%antibiótico para as placas. Em seguida, incubar por 12 dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Continue mudando o meio pelo menos a cada dois dias em uma programação diária consistente.
Em seguida, prepare o meio essencial mínimo complementado com tubos, solução antimicocótica antibiótico, hidrocortisona, insulina, selênio, triiodothyronina e fator de crescimento epidérmico. Substitua o meio de cultura por dois mililitros deste meio preparado. No dia seguinte, substitua-o por um mililitro do meio essencial mínimo no pH 7.
Agora crie um anel de inserção esterilizado usando um anel O de silicone equipado com uma membrana de diálise lavada com ácido. No 13º dia, retire as pastilhas da geladeira, escorra e substitua a água por ácido clorídrico molar de 0,5. Deixe-o em um capô de fluxo laminar por pelo menos uma hora antes de usar.
Em seguida, escorra 0,5 ácido clorídrico molar e enxágue com água estéril de 18 megaohm. Armazene em água estéril de 18 megaohm em uma capa de fluxo laminar até estar pronta para uso. Crie um sistema de duas câmaras inserindo um anel nos poços contendo as células da placa de seis poços e, em seguida, devolva a placa com as pastilhas para a incubadora.
Para preparar a solução pancreatina-bile, adicione 87,5 gramas de resina de troca de cáção fraca ao extrato de pancreatina e bile solubilizado e use um agitador por 30 minutos à temperatura ambiente para misturar os componentes. Despeje o chorume em uma coluna grande e escorra a coluna. Em seguida, centrifugar a coluna eluent.
Pesar a amostra em um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéril. Ajuste o pH usando ácido clorídrico e adicione 10 mililitros de soro fisiológico contendo cloreto de sódio de 140 mililitros e cinco cloreto de potássio mililitro. Em seguida, defina o processo de digestão gástrica adicionando 0,5 mililitros da solução de pepsina suína preparada à amostra.
Em seguida, incubar em um agitador de balanço em um ajuste suave por uma hora a 37 graus Celsius e iniciar o processo de digestão intestinal de cada amostra, ajustando o pH para 5,5 a 6,0 com 1,0 bicarbonato de sódio molar. Adicione 2,5 mililitros da solução de bile pancreatina a cada tubo de amostra e ajuste o pH para 6,9 a 7,0 com bicarbonato de sódio molar 1,0. Utilizando a solução contendo 140 cloreto de sódio mililitro e cinco cloreto de potássio milimila, adicione líquidos para que cada tubo contenha exatamente 15 gramas de material total.
Agora transfira 1,5 mililitros de cada digestão intestinal para a câmara superior do poço contendo as células Caco-2 da placa de seis poços. Substitua a tampa da placa e incuba a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono em um agitador de balanço a seis oscilações por minuto durante duas horas. Remova o anel de inserção com o digestor.
Em seguida, adicione um mililitro de meio essencial mínimo em pH 7 para cada poço e mantenha a placa de volta na incubadora por 22 horas. Agora remova o meio de cultura celular e adicione dois mililitros de 18 megaohm de água à camada mono celular. Transfira para um sônico e colde toda a célula lysate em tubos de micro centrífuga para análises de proteína celular e ferritina celular.
As variedades manteca apresentaram maior disponibilidade de ferro em relação aos controles de referência das classes de cores modeladas brancas e vermelhas por dois anos consecutivos de colheita. A biodisponibilidade de ferro das variedades de feijão branco e amarelo mostrou um aumento após processá-los em farinha. No entanto, a biodisponibilidade de ferro mostrou uma diminuição nas variedades cranberry, rim vermelho e preto.
A cultura de monocamada celular caco-2 adequada é essencial para o uso bem sucedido deste bioensaio. A atenção precisa aos detalhes do crescimento e manutenção é fundamental para a resposta consistente do bioensaio. Esse modelo nega as desvantagens e o alto custo de outras abordagens e permite aos pesquisadores identificar mecanismos e avaliar mais plenamente fatores que inibem e promovem a biodisponibilidade de ferro.
