Este protocolo permite estudar o potencial e a capacidade de Muller glia de converter em células progenitoras de retina após o tratamento com fatores específicos como microRNAs. A vantagem dessa técnica é que os candidatos a microRNA podem ser testados para sua eficiência e resultado antes de seu uso em aplicações in vivo. Ajudando a demonstrar o procedimento estará Seoyoung Kang, um estudante de doutorado do laboratório de Stefanie Wohl.
Primeiro, mergulhe o globo ocular removido brevemente em um tubo com etanol para evitar a transferência de bactérias do animal. Em seguida, lave o globo ocular brevemente na placa de Petri de 10 centímetros antes de colocá-lo na placa de 24 poços no gelo. Uma vez que os globos oculares são removidos e limpos, coloque um olho no prato de dissecção colocado sob um microscópio dissecando com uma fonte de luz.
Agora conserte um globo ocular agarrando o nervo óptico e o tecido conjuntivo circundante ao redor da esclera com Dumont 5 fórceps finos e pressione-o cuidadosamente contra o prato de dissecção. Em seguida, faça um furo no centro da córnea usando uma agulha calibre 30 para facilitar o acesso à tesoura venosa. Em seguida, disseca a córnea ao redor do corpo ciliar usando uma tesoura venosa e remova cuidadosamente a córnea, lente, íris e corpo vítreo com Dumont 5 fórceps finos.
Mais tarde disseque a esclera com uma tesoura venosa até que o nervo óptico seja atingido e extraia cuidadosamente a retina usando fórceps finos Dumont 5. Agora use um segundo fórceps finos Dumont 5 para empurrar contra a retina e remover completamente o corpo vítreo. Transfira as retinas cortadas cerca de 2,5 centímetros da ponta de uma pipeta de transferência estéril para ampliar o diâmetro.
Agora, usando esta dica, pegue retinas inteiras sem danificar o tecido e transfira as retinas para uma nova placa de Petri estéril com HBSS frio e arrase o prato. Em seguida, usando uma nova pipeta de transferência estéril, empurre cuidadosamente as retinas ao redor para lavar as células epiteliais do pigmento da retina. Coloque imediatamente a retina isolada em um novo poço limpo da placa de 24 poços preenchida com um mililitro de HBSS enquanto mantém a placa de 24 poços no gelo durante a dissecção.
Prepare a mistura de dissociação de Papain DNase I, conforme descrito no manuscrito. Agora com uma pipeta de transferência de ponta ampliada, pegue as retinas. Aguarde até que as retinas se acomodem na parte inferior da ponta e solte as retinas sem HBSS excessivos no tubo contendo mistura Papain DNase I.
Em seguida, coloque o tubo em um nutador na incubadora e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius e com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, dissociar as células, encanar cuidadosamente para cima e para baixo com uma pipeta de um mililitro. Depois que as células forem dissociadas, adicione 275 microliters de inibidor de protease ovomucoid do kit de dissociação papain para neutralizar o Papain e misturar suavemente por pipetação para cima e para baixo.
Coloque tubos em uma centrífuga e gire a quatro graus Celsius por oito minutos a uma força centrífuga relativa de 300. Adicione o fator de crescimento epidérmico ao volume calculado de crescimento médio pré aquecido a 37 graus Celsius. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga.
Sem tocar na pelota na parte inferior do tubo, remova o sobrenatante com cuidado e completamente. Agora resuspenja a pelota celular com 500 microliters de fator de crescimento epidérmico complementado meio de crescimento. Em seguida, transfira a suspensão da célula para um poço da placa de 12 poços.
Enxágüe o tubo com outros 500 microliters do fator de crescimento epidérmico complementou o crescimento médio e adicione-o ao poço. Balance a placa do poço cuidadosamente, em seguida, coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius com dióxido de carbono. Comece verificando a confluência celular de 90% a 100%.
Em seguida, retire o meio e adicione um mililitro de HBSS frio para lavar o poço. Balance suavemente a placa e remova o HBSS sem nenhum traço esquerdo. Mais tarde, adicione 500 microliters de uma trippsina pré aquecida contendo solução para separar as células do poço.
Bata suavemente e incubar por dois minutos em incubadora Celsius de 37 graus. Depois de mover a placa da incubadora para o armário de bio segurança, aspire a solução de trypsin contendo enquanto inclina. Disperse-o cuidadosamente e lentamente sobre o poço várias vezes até que as células se desprendem completamente.
Em seguida, transfira esta suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mililitro e coloque tubos na centrífuga. Gire a 300 vezes g por oito minutos a quatro graus Celsius e traga tubos de volta para o armário de bio segurança. Remova o supernatante sem tocar na pelota.
Agora, ressuspenque cuidadosamente a pelota celular adicionando 600 microliters de meio de crescimento pré-aquecido e pipetando para cima e para baixo aproximadamente 30 a 40 vezes. Finalmente, sementes 100 microliters da suspensão celular obtida no centro de seis deslizamentos de cobertura revestidos da placa de 24 poços. Coloque a placa na incubadora e deixe as células se contentarem com a transfecção subsequente usando micro RNA imitações.
A figura mostra condições de controle cinco dias após a transfecção com algumas células positivas Ascl1-Tomate presentes. Após um tratamento miR-25, no entanto, muitas mais células positivas Ascl1-Tomate são encontradas. A quantificação revelou um aumento de quatro vezes no número de células positivas Ascl1-Tomate nos poços tratados miR-25 em comparação com os controles.
Mais importante, a grande maioria das células positivas ascl1-tomate encontradas nos poços tratados riR-25 adotou uma morfologia neuronal. As características dessa morfologia neuronal incluíram redução do tamanho da soma celular, o desenvolvimento de processos finos e a formação de pequenas redes. A quantificação revelou que cerca de 70% de todas as células positivas ascl1-tomate tinham características neuronais.
A rotulagem imunofluorescente mostra que as células positivas de Ascl1-Tomate com morfologia neuronal expressam os marcadores neurais OTX2 e MAP2, confirmando a identidade neuronal. A quantificação dessas células revelou que após a superexpressão miR-25, cerca de 40 neurônios positivos ascl1-tomate por campo estão presentes em comparação com cinco células neuronais por campo em controles. As células neuronais identificadas constituem cerca de 70% da população celular positiva Ascl1-Tomate total das amostras tratadas miR-25.
Além disso, a quantificação do número absoluto de neurônios coexpressos OTX2 e MAP2 mostrou que após o tratamento do miR-25, cerca de 60 neurônios por campo foram encontrados em comparação com 10 neurônios por campo em controles. É imprescindível trabalhar em um ambiente limpo e higienizado com ferramentas limpas e estéreis e trabalhar com cuidado evitando qualquer tratamento severo. Aplicações a jusante podem ser, por exemplo, quantificação de proteínas, análise de DNA ou RNA, ou estudos eletrofisiológicos.
Essa técnica nos ajudou a explorar questões iniciais sobre a reprogramação nuclear que pertence ao campo da medicina regenerativa. E há uma longa gama de fatores e condições que podem ser testados para explorar novas questões.
