Nosso protocolo aborda os efeitos das proteínas reguladoras de ligação de RNA na biogênese e maturação de microRNA, diretamente das culturas celulares. O método que descrevemos pode ser realizado com reagentes de cultura celular comum e é relativamente rápido. Este método pode ser importante para estudar os efeitos fenotípicos das microRNAs e seus alvos em diferentes tipos de células eucarióticas.
Células normais ou semelhantes a doenças podem ser usadas. É importante escolher linhas celulares favoráveis à transfecção, realizar controles adequados de transfecção e indução, a fim de observar as mudanças na afinidade alvo através da atividade luciferase. Para começar, mantenha as células em DMEM, suplemento de alta glicose em placas de Petri de 100 milímetros e incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora atmosférica úmida e controlada com 5% de dióxido de carbono.
Para desapegar células aderentes, incuba-as com a solução trypsin-EDTA a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Para realizar transfeções, misture 200 nanogramas de DNA e 1,25 microlitres de reagente transfecção em 100 microliters do meio de cultura e adicione a mistura de transfecção às células. Em seguida, incubar as células com as misturas de transfecção por quatro horas a 37 graus Celsius.
Em seguida, substitua o meio por meio contendo 10% FBS e incubar por mais 24 horas antes de adicionar os antibióticos para seleção. Para transfetar pFLAG-HuR e MT-pFLAG em HeLa, selecione células aumentando a concentração de Geneticin de 100 microgramas por mililitro para 1000 microgramas por mililitro, gerando linhas celulares estáveis. Em seguida, confirme a superexpressão com PCR quantitativo usando primers específicos para HuR mRNA.
Transfeito os plasmídeos em células HeLa-Cre com 40 nanogramas pTK-Renilla, depois pRD miR 17-92, gerando HeLa-Cre miR 17-92, e selecionando com um micrograma por mililitro puromycina. Em seguida, transfect HeLa-Cre miR 17-92 com pTK-Renilla e pmirGLO RAB1B 3'UTR ou pmirGLO mexido 1B 3'UTR separadamente. Em seguida, selecione usando penicilina e estreptomicina, resultando na geração de luc RAB1B e luc mexido.
Em seguida, transfete as células com pFLAG-HuR ou MT-PFLAG como elas demonstraram anteriormente. Prossiga para a cultura celular com HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 mexido, HeLa-Cre miR 17-92 HuR, e HeLa-Cre miR 1792 HuR bloqueio até que aproximadamente 80% de confluência é alcançado. Em seguida, induz com um microliter de doxiciclina por 30 minutos a 37 graus Celsius e também mantenha todas as células sem doxiciclina como controles para o mesmo período.
Para quantificar e comparar diferentes intensidades de luminescência, use o kit de ensaio de repórter de luciferase dupla. Antes de iniciar o ensaio, descongele as soluções de ensaio de luciferase e deixe-as em temperatura ambiente. Em seguida, prepare a mistura Stop e Glo misturando 200 microliters do substrato em 10 mililitros de amortecedor de ensaio luciferase dois.
Em seguida, misture 10 mililitros de tampão de ensaio de luciferase dois no vile âmbar do substrato de ensaio de luciferase dois para preparar a mistura, LAR II, e agitar bem. Posteriormente, transfira as soluções para tubos de centrífugas de 15 mililitros previamente identificados e protegidos contra a luz. Em seguida, realize as leituras de luminescência utilizando equipamentos como Sinergia e meça luciferase expressa como unidades de luz relativa, e, em seguida, exporte os resultados para uma planilha para análise estatística posterior.
Realize a normalização da atividade de luciferase de vagalume pelo controle Renilla e plote isso como unidades de luz relativas em um gráfico enquanto se repete para grupos com e sem indução de doxiciclina. A superexpressão do HuR após a transfecção de pFLAG-HuR foi confirmada na linha celular HeLa, BCPAP e HEK293T, e observou-se que a superexpressão do HuR nessas células estimula a expressão do miR19A. Observou-se forte redução da atividade da luciferase com a expressão RAB1B 3'UTR sobre o aumento da expressão miR19A e miR19B de pRD miR 17-92, em comparação com as células HeLa-Cre.
A transfecção de pFLAG-HuR em células HeLa não alterou a atividade da luciferase. No entanto, a superexpressão do HuR, juntamente com a suplementação de doxiciclina estimulando a expressão do cluster miR 17-92, reduziu ainda mais a atividade da luciferase. Após a confirmação do papel da proteína de ligação de RNA na maturação do microRNA, a cinética celular e a análise do ciclo celular serão importantes para entender as principais mudanças promovidas pela proteína nos microRNAs.
