A dificuldade com uma única substituição de resíduo é genotipar animais de forma eficiente, apesar da diferença no único resíduo. O uso especial de uma enzima de restrição adiciona apenas um passo único, rápido e de baixo custo ao genotipagem típico baseado em PCR. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer outro modelo de mouse com um ponto de mutação se a sequência de destino for reconhecida por uma enzima de restrição, que geralmente é o caso.
Corte de um a três milímetros da ponta da cauda com uma tesoura limpa e transfira-a para um tubo PCR de oito tiras de 0,2 mililitro. Depois de conter a amostra de cauda como descrito no manuscrito, armazene-a a T-menos 20 graus Celsius até a extração, até cerca de uma semana. Adicione 100 microliters de solução de lise tecidual por tubo e misture bem, seguido de spin-down usando uma minicentrifuagem de mesa a 2.200 vezes G por 10 segundos à temperatura ambiente.
Certifique-se de que as amostras da cauda estão submersas na solução. Coloque os tubos em um cicloviário térmico, programando os parâmetros para lise tecidual, inativação e retenção. Armazene o tecido a quatro graus Celsius por até uma semana se o PCR não puder ser realizado imediatamente.
Prepare uma solução PCR contendo cinco microlitros de água sem nuclease, 0,75 microlitros de primers avançados e reversos de 10 micromolares e 7,5 microlitros de mix mestre PCR por amostra em um novo tubo PCR. Adicione um microliter do tecido previamente preparado à solução PCR. Misture bem a solução PCR e gire para baixo com uma minicentrifugação de mesa a 2.200 vezes G durante 10 segundos à temperatura ambiente.
Coloque os tubos em um ciclo térmico programado. Uma vez concluída a reação, armazene os produtos PCR a quatro graus Celsius por um a dois meses ou aproximadamente um ano a menos 20 graus Celsius. Prepare a solução enzimada contendo sete microlitrais de água sem nuclease, dois microliters de buffer CutSmart com força de 10X e um microliter de enzima de restrição NlaIII.
Se houver várias amostras, multiplique cada conteúdo para fazer a mistura e alíquota de 10 microliters por tubo. Adicione 10 microliters de produto PCR previamente obtidos à solução enzimápica por tubo. Misture bem e gire para baixo com o minicentrifuge de mesa como demonstrado anteriormente.
Coloque os tubos em um ciclo de calor programado ou bloqueio térmico. Armazene o produto após a incubação em condições frias. Adicione 0,75 gramas de agarose em 50 mililitros de tampão TAE de força única.
Misture e aqueça a agarose no micro-ondas até dissolver completamente. Depois de esfriá-lo, adicione cinco microliters de mancha de DNA e misture suavemente. Despeje 25 mililitros do gel de agarose no molde de gel e deixe o gel solidificar.
Carregue 10 microliters do produto PCR digerido para o poço. Execute o gel com 100 volts por 35 minutos. Imagem do gel agarose sob luz ultravioleta.
A eletroforese agarose realizada utilizando o produto PCR digerido resultou em várias faixas de tamanhos diferentes em cada genótipo, com duas bandas em tipo selvagem, três em heterozigous e uma em homozigos, respectivamente. A injeção de teste com análise blastocisto resultou em uma taxa de sucesso de 76,9% na injeção de 50 nanogramas por microliter dos oligos doadores, e uma taxa de sucesso de 25% na injeção de 25 nanogramas por microliter dos mesmos oligos doadores, respectivamente. Finalmente, injetar 50 nanogramas por microliter dos oligos doadores com precipitação de etanol obteve animais fundadores com uma taxa de sucesso de 50%.
A purificação de doadores de oligo por precipitação de etanol reduziu a toxicidade, mantendo alta eficiência de edição de genomas. O manuseio cuidadoso e a adição de uma baixa quantidade de reagentes é muito importante. Certifique-se de que eles são adicionados corretamente e são bem misturados.
