Como os axônios navegam na complexa matriz do sistema nervoso central é uma questão fundamental na neurobiologia. Este protocolo permite o estudo da dinâmica do cone de crescimento e crescimento do axônio no ambiente fisiológico com imagem de alta resolução. Este protocolo descreve um pipeline fácil de usar de ponta a ponta para a entrega de DNA no cérebro embrionário do rato, preparações para fatias organotiplicas de alta qualidade e um guia passo a passo para aquisição e análise de imagens.
Embora originalmente projetado para estudar a dinâmica do axônio no sistema nervoso central embrionário, este protocolo poderia ser ajustado para permitir a cultura organotípica e a visualização da plasticidade do axônio após condições traumáticas ou patológicas. O protocolo em si é relativamente simples. No entanto, alcançar sua primeira rotulagem e preservação de estruturas cerebrais são pontos críticos.
Portanto, as etapas de eletroporação, dissecção cerebral e corte de medidas requerem cuidados extras. Demonstrar que o procedimento será útil, e o doutorando é do laboratório de Bracket. Depois de anestesiar uma fêmea grávida, faça uma incisão para retirar ambos os chifres uterinos usando um broto de algodão encharcado em soro fisiológico quente ou fórceps, cuidadosamente agarrando os espaços entre os embriões.
Em seguida, coloque os embriões em gaze molhada. Depois de cortar o saco uterino, remova cada embrião. Coloque os embriões em um prato de 10 centímetros contendo HBSS suplementado com glicose no gelo.
Para eletroporação ex utero, pegue um embrião e coloque-o no suporte. Em seguida, insira cuidadosamente o capilar de vidro contendo o DNA rápida mistura verde através do crânio do embrião no ventrículo lateral, e injete dois a três microliters da mistura plasmida de DNA em cada ventrículo. Em seguida, segure a cabeça do embrião entre eletrodos de pinça de platina no ângulo apropriado para atingir a área cerebral desejada, com o cátodo voltado para a área onde a transferência de DNA é pretendida.
Pois na eletroporação uterina, depois de retirar os chifres uterinos e colocar os embriões em uma gaze molhada como demonstrado anteriormente, use as pontas dos dedos para girar suavemente o embrião dentro do útero até que as suturas lambdoidal e saggital estejam localizadas. Em seguida, insira cuidadosamente o capilar de vidro contendo a mistura verde rápida do DNA através da parede uterina e crânio de embrião no ventrículo lateral, e injete dois a três microlitradores da mistura plasmida de DNA em um ou ambos os ventrículos como desejado com um máximo de dois microliters por ventrículo. Após a injeção, segure a cabeça do embrião entre eletrodos de pinça de platina no ângulo apropriado para atingir a área cerebral desejada com o cátodo voltado para a área onde a transferência de DNA é pretendida.
Uma vez que todos os embriões necessários tenham sido eletroporados, use um broto de algodão salino encharcado para colocar suavemente os chifres uterinos de volta dentro da cavidade abdominal. Suturar as incisões musculares e cutâneas usando material de sutura 5-0, em seguida, fixar a ferida usando clipes de sutura, e desinfetar a ferida pulverizando-a com betadina. Coloque o mouse de volta na gaiola de recuperação e mantenha o calor usando uma luz de aquecimento infravermelha distante por pelo menos 20 minutos pós-procedimento.
Conserte a cabeça do embrião sob um microscópio de dissecção. Em seguida, remova a pele do crânio cortando ao longo da linha média começando da base da cabeça em direção ao nariz. Descasque a pele no crânio lateralmente fazendo uma grande lacuna suficiente para o cérebro ser extirpado.
Em seguida, para remover o cérebro insira a ponta fechada da tesoura de dissecção estéril começando sob a lâmpada olfativa e movendo-se em direção ao tronco cerebral. Em seguida, corte o tronco cerebral e corte muitos pedaços soltos de meninges ao redor do cérebro. Usando uma colher perfurada, pegue o cérebro e remova o excesso de líquido, esfregando o fundo da colher contra papel de tecido seco.
Em seguida, coloque o cérebro em um prato de agarose no gelo. Em seguida, usando uma colher menor misture a agarose por 10 segundos para mesmo resfriamento, em seguida, manobrar o cérebro para o meio do prato colocando-o horizontalmente com o lado dorsal para cima e garantindo que ele está completamente coberto com agarose de todas as direções. Pegue suavemente o bloco de agarose da estação de trabalho Vibratome e seque o fundo, esfregando contra papel de tecido.
Em seguida, coloque o bloco na área colada do suporte do espécime com o lado rostral do cérebro voltado para cima, e coloque o suporte do espécime no gelo. Deixe a cola secar por um minuto. Corte o cérebro em fatias coronais em um ângulo de 15 graus.
Em seguida, usando espátulas limpas, colete as fatias cerebrais e coloque-as em uma membrana PTFE imobilizada em uma antena de fundo de vidro de 35 milímetros usando Parrafin. Colete até cinco fatias cerebrais por membrana. Em seguida, usando uma pipeta de 200 microliteres remova o excesso de solução de glicose HBSS ao redor das fatias na membrana deixando as fatias semi-secas, em seguida, adicione 500 microliters de mídia de fatia pré-war diretamente ao espaço sob a membrana e incubar as fatias a 35 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Para o crescimento do axônio por imagem, localize uma região do córtex com densidade celular baixa a média. Enquanto para a dinâmica do cone de crescimento de imagens, localize um cone de crescimento na zona imediata do córtex ou zona subventricular. Em seguida, defina um tamanho de pilha Z.
Para o crescimento do axônio em uma grande pilha Z, defina um tamanho de passo de dois micrômetros e para cones de crescimento em uma pilha Z menor, defina um tamanho de passo de um micrômetro. Para análise de dados, abra o arquivo de imagem em Fiji clicando no arquivo e, em seguida, abra e selecione a imagem. Obtenha a projeção de intensidade máxima do lapso de tempo clicando na imagem, seguido de pilhas, projeção Z e projeção de intensidade máxima.
Passe pelo lapso de tempo e localize um axônio em crescimento. Uma vez localizado, desenhe uma linha através do axônio em crescimento, começando pela ponta do axônio no primeiro quadro e seguindo o axônio durante todo o lapso de tempo. Em seguida, canta o plugin kymo re-slice wide.
Defina a escala do kymograph indo para a imagem, em seguida, propriedades. Depois de definir a distância em micrômetros, largura de pixel e o tempo em segundos ou minutos, e altura do pixel, vá analisar e clicar em medida. Para medir o volume do cone de crescimento, abra o arquivo de imagem no software de análise de imagens clicando em arquivo, aberto e selecionando o arquivo de interesse.
Em seguida, selecione o assistente de adicionar novas superfícies na etapa um, em configurações de algoritmo, selecione segmento apenas uma região de interesse, e na segunda etapa, corte o quadro para se encaixar em todo o cone de crescimento em todos os quadros. Em seguida, no passo três, mantenha o limiar em intensidade absoluta e, no passo quatro, garanta que toda a região do cone de crescimento seja limiar. Em seguida, na etapa cinco, no tipo de filtro selecione o número de voxels LMG para um.
Selecione o botão executar para executar todas as etapas de criação e finalizá-lo adicionando novo assistente de superfícies. Finalmente, na guia estatísticas na parte superior da janela do assistente, selecione valores e volumes específicos sob a guia detalhada. Tipicamente, fatias cerebrais cultivadas com sucesso derivadas de eletroporação utericante ou ex utero mostram distribuição celular normal e uma matriz organizada de glia radial com processos de pilo-contato a apicamente orientados.
Ocasionalmente, uma ex eletroporação uteróvia marcou distúrbios nos andaimes gliais radiais e fatias cerebrais cultivadas são observadas tornando este controle de coloração recomendável. Um neurônio cortical piramimático representativo expressando Lyn-mNeonGreen e o comportamento dinâmico de seu cone de crescimento é mostrado aqui. Além disso, os neurônios foram rotulados usando uma sonda de actina expressando plasmida para analisar a dinâmica actina de cones de crescimento axonal in situ.
Experimentos in situ também foram realizados com um duplo cre dre fluorophore expressando design plasmídeo, onde fluoroforos tRFP ou ZsGreen poderiam ser especificamente e individualmente ativados por dre ou cre recombinases, respectivamente em neurônios vizinhos. A partir de kymographs, parâmetros dinâmicos de crescimento, como velocidade de crescimento para vários axônios e volume de cone de crescimento ao longo do tempo são facilmente obtidos. Isso pode ser usado para avaliar a velocidade da esteira actin e o equilíbrio entre filopodia e lamellapodia durante a atividade de exploração do cone de crescimento.
É importante manter a estrutura cerebral e ajustar as concentrações plasmidas para alcançar rotulagem esparsa. Isso é crucial para uma visualização precisa de axônios e cones de crescimento no córtex. Dependendo dos plasmas selecionados e do fundo genético, este protocolo permite que os usuários modifiquem neurônios ou o ambiente em que crescem, permitindo uma ampla gama de estudos.
Ao permitir o acesso de alta resolução aos neurônios in situ, essa técnica permite que os neurocientistas interroguem a interação dinâmica entre cones de crescimento e métricas do sistema nervoso central, tanto em níveis morfológicos quanto moleculares.
