Esse método pode ser usado para ajudar os pesquisadores a analisar e contar co-culturas de células usando uma análise simples e eficaz baseada em área. Esta técnica é relativamente fácil de implementar usando software amplamente disponível e oferece um meio confiável e preciso de identificar vários tipos de células dentro de uma configuração de co-cultura. Este método pode fornecer uma visão de como co-culturas específicas das células sinergizam para ajudar na regeneração tecidual.
Este método também pode ser empregado para validar estudos biomarcadores de monocultura. Para começar, a cultura bruta 264,7 macrófagos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para imagem monocultura em um mililitro de DMEM suplementado com FBS, penicilina-estreptomicina, bicarbonato de sódio e beta-mercaptoetanol em um frasco de cultura celular de cinco mililitros a uma densidade de 25.000 células por centímetros quadrados. Cultura CÉLULAS NIH/3T3 em DMEM suplementadas com 10% FBS e 1%penicilina-estreptomicina.
Para a imagem de cocultura, a cultura bruta 264,7 macrófagos e fibroblastos NIH/3T3 utilizando meio de co-cultura contendo uma parte bruta 264,7 média e uma parte NIH/3T3 média juntos em proporções variadas e densidade total de 25.000 células por centímetro quadrado. Após a semeadura, incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para atingir uma densidade celular viável de 80% de confluência celular. Para adquirir imagens celulares usando um microscópio invertido equipado com o objetivo 40X, determine a capacidade do algoritmo de avaliar com precisão imagens com uma gama de qualidades de imagem.
Adquira imagens em escala cinza com diferentes focos produzindo imagens não bulbus e bulbus e exporte-as no arquivo czi bruto. Para obter imagens de células usando o método baseado em área, copie e cole o arquivo de imagem para análise na lixeira e digite o nome do arquivo executando o comando. Pressione a Corrida para iniciar o programa.
Analise as imagens por abertura por reconstrução, seguido de fechamento por reconstrução usando funções de origem para ampliar o primeiro plano a partir do fundo, executando o respectivo comando. Para binarizar as imagens reconstruídas utilizando um sistema de identificação baseado em percentil, diferencie as células do fundo usando uma diferença percentil do pixel máximo relevante com o maior valor de pixel que compreende pelo menos 0,5% de uma determinada imagem. Analise e avalie os valores dos pixels para macrófagos brutos 264,7, garantindo que os valores estejam dentro de 4,5% do pixel máximo relevante.
Em seguida, marque o pixel como celular. Para imagens contendo perfis de células bulbosas, implemente um procedimento iterativo para corrigir a binarização errônea nos centros das células. Determine um palpite inicial para a cobertura total da célula.
Execute o algoritmo e analise imagens usando estimativas iniciais de alfa e kappa para preencher uma parte das ilhas. Em seguida, use as contagens de células pós-análise e a cobertura para recalcular kappa. Para determinar a área média da célula após a binarização da imagem, obtenha um vetor de todos os locais centrais e raios de círculos encontrados dentro da imagem executando o comando.
Use as saídas de raios para calcular a área celular média, analisando pelo menos 10 células para garantir a identificação precisa da área. Realize a análise de imagem usando os comandos descritos anteriormente. Em seguida, realize uma análise de co-culturas contendo células 264.7 e NIH/3T3 cruas, determinando experimentalmente um parâmetro phi usando imagens de células 264.7 e NIH/3T3 brutas.
Acho que um valor inicial de phi e iterado até que as contagens de células e a cobertura coincidam de perto com as contagens manuais específicas da co-cultura 264.7 e NIH/3T3. Determine a contagem bruta de células 264,7 na cobertura celular total, conforme descrito anteriormente para as imagens de monocultura. Analise a imagem transformada da bacia hidrográfica novamente sem o parâmetro phi, detectando macrófagos e fibroblastos.
Adquira dados de fibroblasto NIH/3T3 subtraindo seletivamente pixels de células brutas de 264,7 obtidos usando os métodos padrão de limiarização e quantificação baseados em área descritos anteriormente. A análise de macrófagos crus não bulbos foram realizadas 264,7 macrófagos e as saídas de algoritmos foram registradas. Cálculos médios de área da imagem usando algoritmo contaram 226 células, enquanto uma contagem manual identificou 241 células com um valor de erro aproximado de 6%A análise de macrófagos 264,7 bulbosos também foi realizada.
Os cálculos médios da área da imagem utilizando algoritmo contaram 221 células, verificadas por uma contagem manual de 252 células com um valor de erro aproximado de 12% A análise das coculturas contendo ambos os macrófagos crus 264,7 e fibroblastos NIH/3T3 foram realizados. As saídas de algoritmo para a contagem bruta de 264,7 macrófagos foram de 137, enquanto uma contagem manual identificou 155 células com um valor de erro aproximado de 11% Para determinar a robustez do algoritmo de contagem de células, cinco imagens brutas de 264,7 macrófagos foram contadas por identificação automática de células e contagem manual de usuários. O coeficiente de Dados foi obtido com um parâmetro médio de 0,85 em cinco imagens.
O passo crítico dentro deste protocolo é o uso de parâmetros baseados em percentil que permitem a detecção robusta de células em imagens de monocultura e cocultura. Este protocolo pode ser usado para identificar células de interesse para análises mais aprofundadas usando técnicas de biologia molecular para avaliar biomarcadores que definem populações celulares específicas e desenvolvimento de biomarcadores em sistemas de cocultura.
