Mitocôndrias dependem fortemente do genoma nuclear, apesar de terem seu próprio DNA. Assim, é necessário um mecanismo de importação altamente regulamentado. Este método ajuda a estudar o processo e como ele pode se adaptar a estímulos externos.
Esta é a única técnica bioquímica disponível para avaliar quantitativamente a importação de proteínas nos vários subcompartidamentos das mitocôndrias. A viabilidade das mitocôndrias está implicada em vários estados da doença, por isso entender como a importação de proteínas é regulada pode ajudar a contribuir para novas abordagens terapêuticas que visam mitocôndrias. Cuidados extras são necessários durante o isolamento para garantir a viabilidade e integridade das mitocôndrias.
É necessário picar completamente o tecido e reutilizar suavemente todas as pelotas subsequentes. Demonstrando o procedimento estará Ashley Oliveira, uma estudante de doutorado no meu laboratório. Para iniciar o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético, remova a gordura e o tecido conjuntivo dos músculos e pique os tecidos em um vidro de relógio pré-refrigerado até que seja um chorume homogêneo.
Coloque o tecido picado em um tubo de centrifugação de plástico pré-refrigerado de 50 mililitros e grave o peso exato. Em seguida, diluir o tecido picado dez vezes com tampão 1 contendo ATP. Use um homogeneizador de lâmina dupla de oito milímetros para homogeneizar a amostra muscular a uma potência de 9,8 Hertz durante 10 segundos, garantindo que não haja pedaços visíveis de músculo restantes.
Depois de girar a amostra a 9.000x G por 10 minutos a quatro graus Celsius, resuspense a pelota cuidadosamente em cerca de 95 microliters do meio de resuspensão. Centrifugar a amostra antes de descartar o supernascer, e resuspensar a pelota suavemente com cerca de 180 microliters de meio de resuspensão usando uma pipeta P-200. Para tradução in vitro, prepare mistura de reação de tradução suficiente para fornecer 20 microliters por amostra de mitocôndrias a serem usadas em experimentos de importação e para uma pista de tradução.
Coloque a reação para incubação a 30 graus Celsius por 30 minutos. 15 minutos após o início da reação de tradução, alíquota de 90 microgramas de mitocôndrias em tubos estéreis de 1,5 mililitro e pré-incubação a 30 graus Celsius por 10 minutos. Em um conjunto fresco de tubos estéreis de 1,5 mililitros, combine 75 microgramas de mitocôndrias com 18 microliters da reação de tradução, e incubar o tubo a 30 graus Celsius pelo tempo desejado.
Mantenha o volume restante da reação de tradução no gelo. Para encerrar a reação de importação após o tempo de incubação apropriado, remova o tubo de 30 graus Celsius para colocá-lo no gelo e, em seguida, transfira cuidadosamente a reação de importação em cima do tubo com a almofada de sacarose. Centrifugar as amostras com almofada de sacarose a 17.000x G por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Usando uma pipeta P-1000, remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota. Para importar para a membrana externa, realize a reação usando Tom40, e resuspenque a pelota em 50 microliters de carbonato de sódio 0,1 molar recém-preparado, e incubar no gelo por 30 minutos. Após a incubação, centrifugar a amostra a 14.000x G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, prepare as amostras para a eletroforese SDS-PAGE, conforme descrito no manuscrito. Prepare a pista de tradução de controle misturando três microliters da reação de tradução restante com 37 microliters de tampão de lise e cinco microliters de corante amostral. Ferva as amostras por cinco minutos a 95 graus Celsius e gire suavemente a uma velocidade baixa para evitar a dotria.
Depois de aplicar amostras no gel de poliacrilamida SDS, ferva o gel em ácido tricloroacético de 5%, ou TCA, em uma capa de fumaça por cinco minutos com agitação contínua. Em seguida, coloque o gel em água duplamente destilada em uma placa giratória por um minuto a 50 rotações por minuto. Lave o gel em Tris de 10 milimões em uma placa giratória por cinco minutos a 50 rotações por minuto.
Para precipitar a proteína, lave o gel em volume suficiente de ácido salicítico de um molar para cobrir o gel em uma placa rotativa por 30 minutos. Para desidratar o gel, coloque uma grande folha de papel manchado no leito poroso do secador de gel, e uma folha de papel toalha na área onde o gel será aplicado. Em seguida, corte 11 centímetros por 9 centímetros de papel manchado e coloque o papel na toalha de papel.
Use um segundo pedaço de 11 centímetros por papel de 9 centímetros para colher o gel do recipiente e coloque o gel no chão em cima da primeira peça. Coloque um pedaço de plástico ligeiramente maior no gel, garantindo que não haja vincos ou bolhas sob o envoltório. Em seguida, deite a tampa plástica da secadora de gel sobre a parte superior do envoltório.
Ligue o vácuo. Certifique-se de que a tampa plástica formou um selo levantando o canto da tampa plástica e esperando a tampa selar. Feche a secadora de gel para funcionar por 90 minutos, começando a 30 graus Celsius para atingir 80 graus Celsius gradualmente, e retorne a 30 graus Celsius no final da corrida.
Enrole o gel no plástico usado no processo de secagem. Uma vez desidratado, o gel se solidificará e sentirá papel fino. Coloque o gel desidratado em um com uma filme fosforoso em cima.
Exponha o filme por 24 horas antes de visualizar o gel usando autoradiografia com qualquer imager adequado capaz de imagens fosforosas. A análise representativa mostra as taxas normais de importação para desidrogenase malate, ou MDH, nas mitocôndrias subsarcolemmal e intermyofibrilar, e o produto de tradução do precursor MDH. A adição de valinomicina inibiu a importação de proteína MDH na matriz das mitocôndrias da SS e do FMI.
Da mesma forma, o detergente Triton X inibiu a importação de MDH em ambas as sub frações devido à solubilização da membrana interna. A estimativa de importação de proteínas foi realizada para o aumento das duraçãos do tempo, e os dados consequentes ilustraram que a importação é um processo dependente do tempo, e as mitocôndrias das SS e do FMI têm diferentes taxas ou capacidades de importação. Quando os ratos foram submetidos à estimulação elétrica, a importação de Tom 40 para a membrana externa foi maior em músculos de animais cronicamente estimulados em comparação com os controles.
A transcarbamilase ornitina, ou importação de OCT, para a matriz mitocondrial foi aumentada em todos os pontos de incubação, resultando em um aumento de 1,4 vezes nas mitocôndrias de músculos cronicamente estimulados. A importação de proteínas foi positivamente correlacionada com um índice de conteúdo mitocondrial e avaliada pela atividade cox. Ao investigar apoptose mediada mitocondrialmente, os animais bax e bak apresentaram importação reduzida de proteínas para a matriz mitocondrial.
Seis semanas de corrida voluntária resgataram o defeito de importação em animais de duplo nocaute. É importante considerar variáveis como a duração da reação de importação e qual proteína deve ser importada. Frações citosóficas podem ser incorporadas à reação para entender como fatores citolíticos podem influenciar a taxa de importação.
Alternativamente, as proteínas podem ser modificadas antes da incubação para entender como as proteínas podem ser seletivamente importadas. Essa técnica pode auxiliar na compreensão das etiologias complexas das miopatias mitocondriais que podem apresentar em vários estados da doença.
