Este método de cocultura ajudará a responder às principais perguntas em torno dos mecanismos de contato celular por trás da regulação de células-tronco mesenquimais da fagocitose de macrófago e, portanto, iluminará o papel do MSC na regulação da imunidade inata. Esta técnica pode ser aplicada em análises de alto rendimento. As biopartículas conjugadas aos corantes sensíveis ao pH fluorescem apenas em ambientes ácidas phagolysosome.
Por isso, lavar e saciar são necessários. Este método também pode ser aplicado a uma variedade de modelos de co-cultura que incluem neutrófilos e outros fagocitos. Demonstrando o procedimento será Ethan Chetkof, um estudante atualmente no meu laboratório.
Para começar, observe a confluência de células-tronco mesenquimais cultivadas. Quando 70-80% de confluência é alcançada, aspire o meio de crescimento das células cultivadas em um prato de 100 milímetros e adicione cinco mililitros de PBS. Após aspirar o PBS, adicione dois mililitros de solução EDTA de 0,05% de trippsina e incuba as células por três minutos.
Após três minutos, verifique o desprendimento celular usando um microscópio invertido. E se as células não forem separadas, incubar por um a dois minutos novamente. Uma vez que todas as células são separadas, adicione cinco mililitros de meio de crescimento fresco à placa.
Depois de enxaguar a placa usando a mistura média de trippsina, use uma pipeta sorológica estéril para coletar células em um tubo cônico limpo e estéril de 50 mililitros. Em seguida, pelota para baixo as células por centrifugação. Depois de aspirar o supernaspe, resuspenque a pelota de célula em 10 mililitros de meio de crescimento fresco, tubos suavemente para cima e para baixo.
Para a contagem celular, adicione 10 microliters de suspensão celular em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 30 microliters de 0,4%Trypan Blue solução, em seguida, adicione 10 microliters da mistura sob a tampa de uma câmara de contagem de hemócitometros. Sob o microscópio invertido ou Brightfield, conte as células viáveis não manchadas usando uma lente objetiva de 10X e quatro câmaras de um milímetro quadrado e calcule o número da célula conforme descrito no manuscrito do texto. Use a equação C1V1 igual a C2V2 para determinar o volume desejado da suspensão média e celular fresca necessária para preparar a suspensão celular em uma concentração final de uma vez 10 para as quintas células por mililitro.
Use um micropipetter multicanal para adicionar 100 microliters da suspensão celular nos poços de uma placa de 96 poços de acordo com o design da placa. Use uma micropipette para adicionar 530 microliters da suspensão celular a cada um dos slides da câmara de acordo com o desenho da placa e incubar durante a noite. Prepare 10 mililitros de meio de ativação contendo gamma interferon a uma concentração de 250 nanogramas por mililitro para ativar as células macrófagos em um prato de 100 milímetros.
Aspire o meio de crescimento das culturas das células macrófagos e enxágue as células com cinco mililitros do meio de ativação desprovidos de interferon gama. Depois de aspirar o meio de lavagem no prato experimental, adicione 10 mililitros de meio de ativação suplementados com interferon gama. E no prato de controle, adicione 10 mililitros de meio de ativação sem interferon gama, em seguida, incubar as células por 16 a 24 horas.
Ao final da incubação, para a preparação das coculturas, remova o meio de ativação das células macrófagos e adicione cinco mililitros de meio de crescimento fresco. Use um levantador de células para raspar suavemente as células e coletar as células em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, conte as células usando a exclusão do Trypan Blue e a hemocittometria, seguidas pela preparação de suspensões de células de controle e macrófago tratadas na concentração de duas vezes 10 a cinco células por mililitro, como demonstrado anteriormente para as células-tronco mesenquimais.
Aspire suavemente o meio dos poços experimentais contendo células-tronco mesenquimais. Use uma micropipette multicanal para adicionar 100 microliters do tratado e as suspensões de células macrófagos de controle nos poços experimentais apropriados de acordo com o desenho da placa e incubar durante a noite, como demonstrado. Aspire suavemente o meio do escorregador de câmara de quatro paredes contendo células-tronco mesenquimais.
Use uma micropipette para adicionar 530 microliters da suspensão das células macrófagos aos poços apropriados de acordo com o projeto e incubar durante a noite. Adicione um mililitro de meio de imagem celular viva ao frasco contendo um miligrama de partículas zymosan e colete a mistura de partículas médias em um tubo de cultura de vidro. Depois de enxaguar o frasco com um mililitro adicional de solução de imagem, transfira o meio de imagem enxaguado no tubo de vidro e adicione três mililitros de solução de imagem adicional para alcançar 0,2 miligramas por suspensão de partículas zymosan mililitro.
Vórtice a suspensão Zymosan usando pulsos rápidos por 30 a 60 segundos, em seguida, use um sonicator sonda para sonicar a suspensão com 60 pulsos rápidos. Após aspirar o meio, enxágue os poços experimentais e os poços em branco de reagente com 100 microliters de solução de imagem celular viva. Em seguida, aspire a solução de imagem de células vivas dos poços e adicione 100 microliters da suspensão Zymosan.
Abra a bandeja da placa do leitor fluorescente usando a interface touch pad. Coloque a placa sem a tampa na bandeja com o poço A1 no canto superior esquerdo. Feche a bandeja usando o touch pad e clique no botão verde de leitura no menu superior.
Para realizar o ensaio de fagocitose, após enxaguar o primeiro poço experimental com 750 microliters do meio de imagem, adicione 400 microliters da suspensão zymosan deixando os poços restantes no meio de crescimento. Em seguida, coloque o slide no estágio incubado do sistema de imagem. Use o software de imagem.
Selecione a opção Brightfield sob a guia localizar e clique no ícone da ocular. Com o objetivo 10X em vigor, use a ocular e o botão de foco para focar nas células. Selecione a guia de aquisição.
Abra o menu suspenso do experimento e selecione um conjunto de comprimentos de onda que inclui o conjunto de filtroS EGFP para acomodar 509 nanômetros de excitação e 533 comprimentos de onda de emissão de nanômetros do corante sensível ao pH. Quando faltar cerca de dois minutos no temporizador, clique no ícone 20X no menu objetivo para alterar o objetivo para 20X, clique no menu de canais, selecione filtros EGFP e, no menu de exposição, defina o tempo de exposição a 400 milissegundos para detectar o fluorophore verde sensível ao pH e clique ao vivo. Depois de ajustar o foco, clique em parar para desligar a luz e marque a caixa ao lado da configuração experimental de lapso de tempo superior.
No menu de estratégia de foco, selecione o foco automático do software e no menu suspenso, selecione configurações inteligentes e centrais para reduzir o tempo de exposição à luz enquanto o foco automático estiver em execução. No menu time-lapse, defina o número desejado de aquisições para 30 a 60, o intervalo para um minuto e clique no botão iniciar o experimento para iniciar a aquisição. O efeito do interferon gama na cocultura foi estudado.
Os resultados representativos demonstram que a co-cultura de macrófagos com células-tronco mesenquimais aumenta a atividade fagocítica do macrófago. O tratamento gama de interferon reduz a atividade do macrófago. No entanto, na presença de células-tronco mesenquimais, a atividade fagocítica do macrófago foi parcialmente resgatada.
As densidades celulares ideais são críticas nesses estudos. E quando as células macrófagos foram banhadas a uma densidade muito baixa, mudanças na intensidade da fluorescência não foram detectadas. Quando as células macrófagos foram banhadas a uma alta densidade, a intensidade da fluorescência foi elevada rapidamente em todos os grupos e as diferenças não foram discernidas.
Uma das coisas mais importantes durante este procedimento é garantir que as densidades celulares sejam otimizadas e mantidas consistentes entre os experimentos.
