Este protocolo de produção de vetores virais AAV é econômico e produz alta pureza, alto título, AAV de grau de pesquisa para uso em modelos animais pré-clínicos e grandes. Esta técnica utiliza células HEK293 aderentes em câmaras de cultura celular, que é eficiente no tempo e menos prática, permitindo menos interrupções nas células. Este protocolo pode ajudar muito na produção de vetores virais para o campo da terapia genética, e também pode ser usado para a produção de outros sorotipos AAV que também ligam sulfato heparan.
Para começar, colete células HEK293 da cultura quando atingir 80% de confluência. Aspire a mídia antes de lavar suavemente a placa de cultura celular com três mililitros de PBS. Em seguida, aspire PBS e adicione três mililitros de trippsina.
Incubar as placas por dois minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, neutralize a trippsina, adicionando sete mililitros de DMEM completos à placa, e colete o supernatante em tubos cônicos de 50 mililitros. Inverta suavemente os tubos para garantir que as células sejam homogêneas.
Para determinar a densidade celular, misture 10 microliters das amostras celulares com 10 microliters de azul tripano. E adicione a mistura a um slide de contagem de células para analisar no contador de células. Misture a suspensão celular com um litro de DMEM completo pré aquecido para ver a câmara de cultura.
Gire suavemente a câmara para distribuir as células uniformemente. Incubar a câmara a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Além da câmara de cultura celular, as células de cultura a 10 a 4 centímetros quadrados em uma placa de 15 centímetros como referência para confluência.
Após 65 horas de incubação, quando as células são 80 a 90% confluentes, adicione lentamente a mistura polietileneimina-DNA e DMEM na porta da câmara de cultura celular. Distribua o líquido uniformemente para todas as linhas antes de incubar a 37 graus Celsius, e 5% de dióxido de carbono por 72 horas. Após a incubação, agite a câmara de cultura celular vigorosamente para desalojar as células até que a mídia pareça turva, e despeje-a em quatro ou 500 mililitros de tubos de centrífuga.
Pelota as células por centrifugação a 18.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Despeje o supernatante esclarecido em uma garrafa PETG de um litro e resuspenque as pelotas de célula em 50 mililitros de tampão licenciado em tubos de centrífugas de 500 mililitros. Incubar os tubos por 60 minutos a 37 graus Celsius.
Após a incubação, centrifufique os tubos a 18.000 vezes G por 30 minutos, e transfira o supernasal para a mesma garrafa PETG de um litro. Armazene a menos 80 graus Celsius. Descongele o lise bruto a quatro graus Celsius durante a noite.
Uma vez descongelado, filtre-o usando um filtro de 0,22 mícrons. Imediatamente antes das etapas de purificação, passivar o concentrador centrífuga adicionando quatro mililitros de tampão de pré-tratamento de filtro para cada coluna heparina-sepharose que está sendo usada. Coloque a tubulação em uma bomba peristáltica.
Executar sequencialmente as soluções e a mídia. Prepare-se para a cromatografia anexando uma coluna de heparina-sepharose de cinco mililitros à tubulação, e executando 25 mililitros de Bazell DMEM através da coluna. Em seguida, carregue 0,2 micromolar do lise bruto filtrado na coluna a uma taxa de fluxo de uma a duas gotas por segundo.
Lave a coluna sequencialmente para elute cinco mililitros cinco vezes com 300 mililitros de cloreto de sódio HBSS, com magnésio e cálcio, e rotule as cinco eluções como E1 a E5. Quando estiver pronto, gire o concentrador centrífugo contendo o buffer de pré-tratamento a 900 vezes G por dois minutos. Descarte o fluxo. Lave o filtro concentrador centrífugo com quatro mililitros de HBSS com magnésio e cálcio girando a 1000 vezes G por dois minutos.
Em seguida, adicione o Elution E2 ao concentrador centrífuga e gire a 1000 vezes G por cinco minutos. Descarte o fluxo. Da mesma forma, gire o E3 de elução no concentrador centrífuga até que o vírus concentrado seja aproximadamente um mililitro.
Remova o vírus concentrado do concentrador centrífuga usando uma ponta filtrada P200 e colete-o em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro estéril. Após a coleta do vírus, enxágue o concentrador centrífuga com 200 microlitadores de HBSS com magnésio e cálcio. Pipeta para cima e para baixo vigorosamente por 30 segundos para desalojar qualquer vírus aderido à membrana, e coletar o vírus concentrado no mesmo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Misture bem o tubo. Lave a coluna e saturar com 20% de etanol antes de armazenar a quatro graus Celsius. Armazene a tubulação da bomba em um hidróxido de sódio molar.
A eficiência transdutor do capsídeo AAV6.2FF foi comparada em camundongos, hamsters e cordeiros por 28 dias após a administração intramuscular. Camundongos administrados cinco vezes 10 ao 12º genoma vetorial por quilograma de IgG humano AAV6.2FF, expresso entre 171 a 237 microgramas por mililitro de IgG humano no soro. Hamster é administrado duas vezes 10 para o 13º genoma vetorial por quilograma de IgG humano AAV6.2FF, expresso níveis muito mais altos de IgG humano do que os camundongos.
Enquanto o grande modelo animal foi capaz de expressar uma média de 35 microgramas por mililitro dos níveis de IgG humanos no plasma. Grandes modelos animais podem determinar a expressão do transgene AAV in vivo, e determinar se os transgenes têm efeito terapêutico contra a desordem ou doença de interesse. O estudo mostrou a grande capacidade de transdução do AAV6.2FF, um novo vetor de sorotipo AAV 6 no músculo esquelético, bem como a baixa imunogenicidade dos vetores virais AAV in vivo.
