O detalhe fornecido neste protocolo, aborda a geração equivalente da pele humana, que muitas vezes é tecnicamente desafiadora. Novos elementos de protocolo equivalentes à pele humana, como vasculatura e imagem volumosa estão incluídos. A técnica permite a construção direta de um modelo de pele que combina mais de perto o tecido in vivo para o estudo de doenças, envelhecimento e medicina personalizada.
A parte mais desafiadora deste protocolo é uma transição entre submersão e interface ar-líquido. Provavelmente serão necessários alguns testes para otimizar o tempo e os níveis de mídia para resultados consistentes. Para começar, adicione 516 microliters de mídia a um tubo de tampa fria, e adicione imediatamente 375 microliters de colágeno frio usando a pipeta de deslocamento positivo de 1000 microliteres.
Remova a ponta de pipeta vazia e mude para a pipeta de deslocamento positiva preparada de 250 microliter para misturar. Misture rapidamente, mas suavemente para evitar o excesso de formação de bolhas. Mantendo a ponta na solução, misture uniformemente de diferentes posições do tubo até que a solução seja de cor homogênea, que normalmente leva cerca de cinco ciclos de pipeta ou 10 segundos.
Disperse imediatamente 125 microliters de colágeno acelular na membrana da inserção de cultura de 12 poços. Para garantir a cobertura uniforme, incline a placa e use a ponta da pipeta para pintar a membrana, espalhando suavemente o colágeno ao redor. Mova imediatamente a placa de 12 poços para uma incubadora de cultura celular Celsius de 37 graus para deixá-la gel por pelo menos 20 minutos.
Após o período de gelação, tire a placa de 12 poços de colágeno acelular da incubadora. Retire o tubo tampado de 1,7 mililitro do gelo molhado e, em seguida, remova o colágeno de estoque da refrigeração e coloque-o em gelo molhado com a tampa aberta. Adicione 516 microliters de suspensão celular resfriada ao tubo tampado frio.
Use a pipeta de 1000 microliteres para imediatamente pipeta 375 microliters de solução de colágeno frio diretamente na solução dentro do tubo tampado. Expulse todo o colágeno da pipeta para dentro do tubo e descarte a ponta de pipeta de deslocamento positiva. Mude imediatamente para a pipeta de 250 microliteres e misture a solução de colágeno Uma vez misturado, transfira 250 microliters de solução de colágeno celular para o colágeno acelular suporta na inserção de cultura de 12 poços, em seguida, mova a placa de 12 poços para uma incubadora de cultura celular de 37 graus Celsius.
Após o tempo de gel de 30 minutos, incline suavemente a placa para avaliar a gelação e certifique-se de que o colágeno se solidificou. Adicione 500 microliters e 1000 microliters de mídia de mistura à câmara superior e câmara inferior da inserção, respectivamente. Certifique-se de que o gel de colágeno está submerso, adicionando mais mídia, se necessário.
Coloque a placa do poço na incubadora de cultura celular para incubação durante a noite. No sétimo dia de submersão, use uma pipeta manual para coletar e descartar mídia da câmara inferior e superior de cada poço de construção. Para coletar a mídia presa diretamente sob a membrana permeável, coloque a ponta da pipeta sob a membrana, derrubando a inserção do lugar temporariamente.
Adicione um mililitro de pele humana equivalente ou mídia HSE complementada com 5% FPS à câmara inferior de cada poço e 200 microliters de suspensão celular à câmara superior de cada poço. Semente os queratinócitos diretamente na superfície de construção dérmica e permita que eles se acomodem por duas horas na incubadora. Duas horas após a semeadura dos queratinócitos, adicione cuidadosamente 300 microliters de mídia HSE, complementados com 5%FPS na câmara superior de cada poço de construção.
Depois de carregar a mídia, coloque a construção de volta na incubadora. Usando uma pipeta manual, levante cada construção para sua interface ar-líquido, ou ALI, removendo resíduos de mídia apenas da câmara superior. Tente chegar o mais perto possível da camada epidérmica sem tocá-la ou danificá-la.
Incline as placas ligeiramente em diferentes ângulos para coletar a mídia, em seguida, adicione aproximadamente dois mililitros de água estéril aos poços circundantes na placa para manter a umidade consistente. Verifique a placa algumas horas depois para ter certeza de que os queratinócitos ainda estão no ALI. Remova qualquer mídia na câmara superior, acompanhando a quantidade de mídia removida de cada poço.
As camadas epidérmicas devem parecer hidratadas, não secas, mas não deve haver mídia agrupada em cima da construção. Para preparar a construção para coloração imunofluorescente, vire uma inserção de cabeça para baixo e coloque-a sobre seu poço na placa do poço. Estabilize a inserção com uma mão enquanto usa fórceps finos ou uma faca de precisão para cortar cerca de metade da circunferência da membrana.
Corte o mais perto possível da caixa de plástico. Usando os fórceps finos da ponta, pegue a borda do retalho da membrana cortada e retire delicadamente a membrana porosa da inserção, bem como a construção VHSE. Se a construção ficar presa na lateral da câmara, use os fórceps finos ou uma pequena scoopula para movê-la para o poço.
Uma vez que o VHSE esteja no poço, descarte quaisquer pedaços restantes da membrana de inserção e mantenha a carcaça de inserção de cultura em cada poço para manter os VHSEs em uma posição submersa durante a coloração. Dois dias antes da imagem, prepare polidimtilsiloxano ou PDMS. Coloque qualquer recipiente de mistura limpo em um equilíbrio de pesagem e coloque a balança.
Adicione a base e adicione o crosslinker. Mexa a solução vigorosamente por pelo menos quatro minutos, criando pequenas bolhas. Depois de misturar o suficiente, despeje o PDMS em uma placa de Petri de 90 ou 100 milímetros.
Degas o PDMS em uma câmara de vácuo até que todas as bolhas desapareçam e o PDMS esteja limpo. Solte o vácuo lentamente e remova o PDMS. Coloque o prato em um forno para curar durante a noite a 50 a 60 graus Celsius, certificando-se de que o prato está sentado plano para PDMS curar uniformemente.
Um dia antes da imagem, use um soco de aço ou uma faca de precisão portátil para perfurar ou cortar um poço circular da folha PDMS, em torno do mesmo tamanho da construção VHSE. Corte um patch quadrado ao redor do poço circular para criar um único PDMS bem. Usando um deslizamento de tampa de vidro de tamanho semelhante ao do PDMS adicione cola cianoacrilato à superfície inferior do PDMS e esfregue uniformemente com uma ponta de pipeta descartável.
Centralizar o vidro e pressioná-lo para o PDMS bem, deixando uma janela de vidro transparente dentro do círculo perfurado. Deixe a cola secar durante a noite antes de usar. A caracterização da epiderme e da derme mostram marcadores imunofluorescentes apropriados para a pele humana nas construções VHSE.
Cytokeratin 10 é um marcador de queratinócito de diferenciação precoce que geralmente marca todas as camadas suprabásiais em equivalentes de pele. Involucrina e filaggrina são marcadores de diferenciação tardia em queratinócitos e marcam as camadas mais suprabásas mais altas em equivalentes de pele. A limpeza do VHSE permitiu uma imagem simples em uma configuração e eliminou a necessidade de reorientar a construção para imagem da derme e epiderme separadamente.
Imagens volumosas possibilitam gerar renderizações 3D para mapear vasculatura em cada construção. Pilhas de imagens foram carregadas em software computacional e um algoritmo personalizado foi usado para renderização e quantificação 3D. A esqueletização determinou o centro definitivo de cada vaso marcado por colágeno IV e os dados resultantes foram utilizados para calcular o diâmetro do vaso, bem como a fração vascular.
Após esse procedimento, métodos de caracterização como análise de barreiras, microscopia eletrônica de varredura, perfis lipídeis e outros podem ser realizados para entender como a vasculatura afeta especificamente a maturação e estabilidade epidérmica. Este protocolo permite estudos específicos do tecido e do tipo celular em um modelo de pele vascularizada. É particularmente adequado para pesquisas em envelhecimento e medicina personalizada.
