Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da National Defense Medical College e de uma bolsa de pesquisa em Saúde e Ciências do Trabalho para pesquisas sobre doenças intratáveis do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão.

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal da National Defense Medical College (nº 16058). Os animais foram mantidos em chow de laboratório padrão (CLEA Japan Inc, Tóquio, Japão). Os animais de laboratório foram tratados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde.
1. Coleta e separação de linfócitos
NOTA: Uma vez que os linfócitos devem ser frescos e não podem ser armazenados, eles devem ser coletados de ratos para cada experimento. Além disso, os linfócitos gut-tropic devem ser coletados diretamente do duto torácico onde circulam. Espera-se que todos os procedimentos sejam concluídos dentro de 6 horas, e todos os instrumentos, luvas e superfícies estejam limpos. Para manter os animais em estado fisiologicamente estável, todos os soro fisiológicos e outros fluidos utilizados no experimento devem ser mantidos aquecidos.
<ol><li>Forme um tubo de canulação (1 mm de diâmetro) como uma curva de heparina (um raio de cerca de 5 mm) depois de mergulhá-lo em água quente (cerca de 80-90 °C) e fixá-lo em uma placa de plástico usando fita adesiva por algumas horas de antecedência.</li>
	<li>Anestesiar um rato Wistar macho (8-12 semanas) com injeção intraperitoneal de uma mistura de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) e Betulphar (2,5mg/kg) e cortar o cabelo do abdômen usando um cortador de cabelo. Retire o cabelo firmemente após a barba para que o cabelo não entre na cavidade abdominal.</li>
	<li>Após confirmar que a profundidade estável da anestesia necessária para o procedimento é obtida por beliscão do dedo do pé, faça uma incisão com tesoura cirúrgica horizontalmente da linha média para a área subcostal esquerda. Tenha cuidado para não danificar os vasos sanguíneos no peritônio parietal observando os vasos sob luz.</li>
	<li>Enrole o estômago com gaze molhada e mova o estômago suavemente para o lado de fora do corpo para revelar os órgãos retroperitoneais. Insira um entalhe entre os músculos eretores da coluna vertebral e o tecido adiposo usando uma tesoura cirúrgica e separe-os sem rodeios com os dedos.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor do duto torácico. O excesso de tecido conjuntivo aumenta com a idade. Expor o duto torácico de pouco abaixo das cruzes esquerdas do diafragma caudal até que um comprimento de 20 mm do ducto torácico fosse visível. Separe suavemente as aderências entre o ducto torácico e a aorta usando pinças de precisão ou cotonetes de algodão molhados.<ol>
<li>Realize este processo com cuidado porque alguns ratos têm artérias ramificadas da artéria abdominal atravessando o ducto torácico ou um curto ducto torácico devido a uma posição mais alta do plexo linfático (pequenos dutos torácicas se espalhando como teias de aranha). Evite contato desnecessário com o ducto torácico para evitar induzir edema.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique uma ligadura por uma corda (3-0 de seda) no duto torácico logo abaixo das crus esquerdas do diafragma. O ducto torácico caudal fica distendido.</li>
	<li>Faça um orifício (5 mm de diâmetro) na parede abdominal esfaqueando a borda de corte da tesoura cirúrgica, passe o tubo de canulação curvado do grampo de cabelo e liga o tubo no músculo iliopsoas em um ponto. Encha o tubo de canulação com soro fisiológico normal contendo heparina de 10 U/mL.</li>
	<li>Depois de colocar uma corda (3-0 de seda) sob o ducto torácico distendido, esfaqueie o ducto torácico com a borda afiada de um tubo de canulação, cannulate-o em direção à cauda cerca de 5 mm, e liga o duto torácico com tubo de canulação para fixação.</li>
	<li>Para fornecer soro fisiológico para evitar a desidratação, crie um orifício (3 mm de diâmetro) na parede anterior do antrum do estômago usando pinças de precisão e passe o tubo de silício (2 mm de diâmetro) para o duodeno através do anel pilórico. Depois de costurar uma ferida e manter os animais nas gaiolas de Bollman, comece a infundir soro fisiológico carregado de açúcar no duodeno de cada rato a partir do tubo de silício a uma taxa de fluxo de 3 mL/h. Cubra toda a gaiola com uma toalha de papel para mantê-la aquecida.</li>
	<li>Fixar o tubo de canulação ao orifício no centro da tampa de um tubo cônico de 50 mL no gelo contendo heparina de 6 U/mL, soro bovino fetal de 10% e meio RPMI 1640 (pH 7,4; ver a tabela de materiais) e coletar linfócitos de ducto torácico (TDLs) no gelo. Tenha cuidado para não entrar em contato com a ponta do tubo para a parede do tubo cônico para evitar a oclusão do tubo cannulado devido à formação de coágulos fibrinas dentro do tubo. O fluido linfático (cerca de 20 mL) incluindo cerca de 1,0 x 108~109 linfócitos pode ser obtido em 6 horas. Para obter os linfócitos sob anestesia completa, o plano de anestesia é monitorado e o fluxo linfático é observado adequadamente. Os mesmos anestésicos são adicionados na mesma dose cerca de 3 horas depois que ratos são colocados na gaiola de Ballman para obter anestesia profunda continuamente por 6 horas.</li>
</ol>2. Rotulagem de linfócitos com carboxyfluorescein diacetate éster succinimidyl (CFDSE)
<ol><li>Dissolver CFDSE (Tabela de Materiais) em sulfóxido de dimetil (DMSO) a 15,6 mM (500 μg de CFDSE dissolvido em 60 μL de DMSO).</li>
	<li>Incubar linfócitos (1 x 108~109) em 50 mL de RPMI 1640 com 50 μL de solução CFDSE por 30 min a 37 °C, como descrito anteriormente10.</li>
</ol>3. Configuração experimental para estudos microvasculares
<ol><li>Anestesize os ratos receptores (8-12 semanas) com injeção intraperitoneal de uma mistura de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) e Betulphar (2,5mg/kg) e confirme a profundidade da anestesia por pinça do dedo do dedo. Molhe o abdômen antes de preparar a pele para minimizar a contaminação do cabelo. Em seguida, abra o abdômen do receptor Wister rato através de uma incisão midline.</li>
	<li>Coloque um rato em uma placa portátil de aço inoxidável (cerca de 120 x 300 mm) com um orifício de retângulo ao redor do centro coberto com um escorregador de vidro (24 x 50 mm). Escolha cerca de 10 cm do segmento ileal, incluindo PPs para observação.</li>
	<li>Mantenha o intestino o mais quente possível e úmido com salina tamponada de fosfato (PBS) aquecida a 37 °C. Mergulhe a gaze que é usada para cobrir o intestino delgado com PBS.</li>
	<li>Ao mesmo tempo em que dá anestesia contínua com isoflurane de 2 % (ver tabela de materiais), coloque o slide no palco do microscópio e escolha áreas adequadas para observação da microcirculação em PPs onde alguns HEVs estão correndo pelo serosa. Os PPs variam em tamanho; os maiores são adequados para observação da microcirculação usando CLSM. O intestino delgado não é reto em lugares; um segmento reto de pelo menos 2 cm de comprimento sem qualquer tensão é adequado para observação.</li>
	<li>Cubra o segmento intestinal adjacente e mesenteria com algodão absorvente encharcado com PBS. Coloque o segmento do intestino entre duas bolas de algodão enroladas e posicione-o o mais longe possível do corpo do rato para evitar que ele seja vibrado pelos batimentos cardíacos e respiração do rato.</li>
	<li>Usando uma seringa de 1 mL, injete lentamente (mais de 1 min) TDLs rotulados com CFSE (1 x 108 células) na veia jugular dos ratos receptores. Uma injeção intravenosa rápida pode influenciar a circulação sistêmica.</li>
</ol>4. Microcirculação de linfócitos
<ol><li>Monitore continuamente os TDLs na microvasculatura de PPs usando CLSM e grave em um computador por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo em intervalos de 30 s. A profundidade do serosa ao HEV de PPs é de cerca de 25 μm, permitindo a observação dos vasos linfáticos estroma e capilar a uma profundidade de 30 μm.</li>
	<li>Injete o Texas Red-dextran (25 mg/kg) na veia jugular de cada rato receptor para manchar a corrente sanguínea e Hoechest 33342 (5 mg/kg) para manchar os núcleos celulares.</li>
	<li>(Opcional) Para quantificar a dinâmica do linfócito, defina linfócitos aderindo aos HEVs por mais de 30 segundos como "linfócitos adesivos" e linfócitos emigrando de HEVs para stroma como "linfócitos migratórios". Em seguida, calcule a porcentagem média de migração (linfócitos migratórios / linfócitos adesivos + linfócitos migratórios) por campo de visão (aproximadamente 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos um protocolo para coletar linfócitos ingenuos e trópicos ingenuos e observar sua migração em PPs de ratos. Esses procedimentos podem revelar como os linfócitos se movem na microvasculatura dos PPs e possibilitar comparar visualmente sua dinâmica em uma condição normal ou medicada. A observação direta dessas dinâmicas tem muito mérito em obter uma pista para modificação imunológica por algumas drogas, embora o período observacional seja limitado a apenas algumas horas.
Mencionamos algumas dicas nos métodos. Entre eles, um dos procedimentos mais delicados é que o operador deve cannular o ducto torácico de forma rápida e precisa. Se uma operação demorar muito tempo e envolver danos desnecessários, ocorrem sangramentos significativos e inflamação, resultando em uma diminuição da coleta de TDL devido ao edema do tecido conjuntivo e obstrução do ducto torácico. Costumávamos cannutar o tubo depois de criar uma pequena incisão no duto torácico usando uma tesoura com uma pequena borda de corte. No entanto, este procedimento interfere no local da canulação devido à drenagem de linfáticos. Portanto, agora não cortamos o duto torácico; em vez disso, nós esfaqueá-lo com uma borda afiada. Este método facilita a cannulação e aumenta as taxas de sucesso. Além disso, o local de incisão no ducto torácico é muito importante por causa da cavidade abdominal limitada. Se o local da incisão estiver muito próximo do diafragma, a parte curva do tubo de cannulação colidiria contra o diafragma. Se estiver muito longe do diafragma, também é difícil cannular o tubo profundamente o suficiente para garantir a fixação devido ao plexo linfático do ducto torácico caudal. Mesmo em casos de boa cannulação, o tubo de canulação pode ser facilmente ocluído pela formação de fibrina. Assim, recomendamos lavar periodicamente o tubo com heparina.
Os recentes avanços no CLSM permitiram observar a área focalizada de forma mais clara e precisamente em tempo real em comparação com um estudo anterior11. Agora usamos CLSM em nosso laboratório, mas podemos observar a microcirculação com mais clareza usando um microscópio multifotográfico. Embora o protocolo exija modificação em vários pontos, juntamente com o andamento técnico, permite a observação da área localizada do órgão de interesse12,13.
O mérito e a chave do método é que envolve separar linfócitos de animais receptores, incuba-los usando qualquer tipo de composto in vitro e observá-los após sua injeção em animais receptores. Isso possibilita elucidar apenas os efeitos dos linfócitos. Pelo contrário, se quisermos elucidar os efeitos de qualquer tipo de compostos em outras células além de linfócitos, como o endotélio vascular, podemos tratar animais receptores com qualquer tipo de compostos e observá-los após a injeção de linfócitos de controle. Para elucidar as mesmas coisas usando camundongos, devemos criar animais geneticamente manipulados condicionalmente um a um. Além disso, a triagem dos linfócitos isolados utilizando marcadores de superfície específicos permitiria estudar a dinâmica de tipos específicos de linfócitos.
Como mostrado no vídeo deste estudo, os linfócitos se movem indefinidamente e lateralmente através do endotélio vascular do corpo real, por isso é difícil avaliar os efeitos sobre seu comportamento utilizando observações in vivo apenas. Além disso, se o mecanismo de ação de uma droga administrada for examinado, ele é originalmente inadequado para examinar cada local de ação. O mérito deste estudo é que, separando linfócitos e incubando-os in vitro, os efeitos medicinais podem ser examinados separadamente nos lados vascular e linfócito. Menos variáveis são mais fáceis de analisar.

As manchas de Peyer (PPs) consistem em centenas de folículos linfoides na álmina propria do intestino delgado. Os PPs são divididos em folículos, região interfollicular e centros germinais localizados na parte inferior dos folículos, onde linfócitos são estimulados pela apresentação de antígeno. Não há vasos linfáticos diferentes, e os antígenos invadem a órmina propria do lúmen intestinal através da camada celular epitelial. A região epitelial que cobre folículos linfoides é chamada de epitélio associado ao folículo, dentro do qual células M intercaladas especializadas captam antígenos mucosais. As células M tomam antígenos do lado luminal e os antígenos são então capturados por células dendríticas e apresentados em direção a linfócitos ingênuos que fluem para PPs através do endotélio de venules endoteliais elevados (HEVs)1. Os PPs desempenham um papel importante na imunidade intestinal e estão relacionados com o estágio inicial da inflamação. Muitas interações moleculares envolvem a entrada de linfócitos a órgãos linfoides secundários (SLOs), incluindo moléculas de adesão, quimiocinas2,3e sphingosina-1-fosfato4; assim, há muitos alvos terapêuticos esperados. Portanto, observar a dinâmica do linfócito dentro dos PPs nos permite vislumbrar o estágio inicial da inflamação e examinar a utilidade de várias drogas promissoras.
O método aqui se concentra na migração de linfócitos em PPs, que inclui vários procedimentos (cannulação no ducto torácico5 e coleta de linfócitos e observação a longo prazo após a injeção em linfócitos coletados). Como esses procedimentos são complexos e foi difícil ver exatamente como cada procedimento foi realizado em relatórios anteriores, mencionamos aqui algumas dicas para conseguir uma observação bem sucedida. Por exemplo, a canulação dos tubos no ducto torácico foi muito difícil, e a taxa inicial de sucesso da canulação foi inferior a 50%. No entanto, melhoramos o método e alcançamos uma taxa de sucesso superior a 80%. Mencionamos algumas outras dicas neste manuscrito que são necessárias para a observação bem sucedida para permitir a avaliação quantitativa da migração transendotelial de linfócitos em várias condições.
Em relatórios anteriores, era difícil entender as mudanças tridimensionais ao longo do tempo, como a injeção intravenosa de tinta da Índia para manchar a estrutura vascular dos PPs6, ou o microscópio sendo monofocal7. Nos últimos anos, um método observacional utilizando alguns animais transgênicos de proteína fluorescência fotoconvertível, como camundongos Kaede, esclareceu movimentos celulares sistemáticos in vivo8. O outro estudo esclareceu o desligamento independente do CD69 da saída de linfócitos dos PPs9. Utilizamos microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM) devido à sua alta capacidade analítica. Agora podemos facilmente obter imagens de alta resolução e usá-las para analisar a dinâmica do linfócito.
Neste relatório, demonstramos uma série de métodos para avaliar a migração de linfócitos em PPs. Primeiro, mostramos métodos refinados de cannulação do ducto torácico para coletar linfócitos. Em segundo lugar, melhoramos os métodos observacionais de várias maneiras para manter órgãos objetivos sempre que possível sob observação microscópica, permitindo-nos obter imagens de alta qualidade por 3 horas. Em terceiro lugar, quantificamos os movimentos celulares da migração de linfócitos para avaliar os efeitos de alguns medicamentos. Esses protocolos modificados contribuirão para o desenvolvimento de avaliações de imunologia mucosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:913px;" width="913">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">A1R+</td>
			<td style="width:213px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:265px;">Comfocal Laser Scanning Microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechest 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:119px;">099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Texas Red&#8211;dextran</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Linfócitos ingênuos recirculam do sangue para os tecidos linfoides sob condição fisiológica e é comumente reconhecido como um fenômeno importante na imunidade intestinal. O estroma de órgãos linfoides secundários, como as manchas de Peyer (PPs) ou linfonodos mesentéricos, são onde linfócitos ingênuos sentem antígenos. Linfócitos ingênuos circulam pela corrente sanguínea para alcançar venules endoteliais elevados, o portal de entrada em PPs. Estima-se que alguns imunomoduladores influenciem a migração de linfócitos, mas a avaliação precisa da dinâmica da microcirculação é muito difícil, e estabelecer um método para observar a migração de linfócitos in vivo pode contribuir para o esclarecimento dos mecanismos precisos. Refinamos o método de coleta de linfócitos do ducto linfático e observação da dinâmica detalhada dos linfócitos gut-trópicos em PPs de ratos. Escolhemos microscopia de varredura a laser confocal para observar PPs de ratos in vivo e gravamos usando fotografia de lapso de tempo. Agora podemos obter imagens claras que podem contribuir para a análise da dinâmica do linfócito.

Coleta de linfócitos de linfáticos Para preparar o rato para a canulação do ducto torácico, faça uma incisão no tenso ducto torácico como mostrado na Figura 1 e, em seguida, mantenha o rato na gaiola de um Bollman, como mostrado na Figura 2.
Quando os linfócitos são bem coletados, podemos obter cerca de 20 mL /6 h de fluido linfático contendo cerca de 107~108/mL linfócitos. Dos TDLs, 70% expressam CD4, entre os quais cerca de 90% das células expressam CD62L, o que significa a composição principal de TDLs (>60%) consiste em linfócitos ingenuos. Uma vez que os linfócitos coletados aqui são células que migram especificamente para o trato intestinal, são adequados para avaliar o estado de migração nas manchas de Peyer.
Observação microscópica Depois de injetar uma dose adequada de linfócitos fluorescentes, monte o intestino do rato receptor em uma lâmina de vidro, como mostrado na Figura 3. Uma imagem microscópica de PPs na condição fisiológica é mostrada na Figura 4.
Para a micro-observação, os ratos podem ser anestesiados sob laparotomia por cerca de 3 horas. Linfócitos aderem a HEVs, rolam e migram para o estroma circundante, e depois migram para capilares linfáticos. Quantificamos e avaliamos o percentual de linfócitos que migraram no estroma dentro do período de observação.
Após a injeção de uma dose adequada de linfócitos fluorescentes, linfócitos gut-trópicos começam a aderir aos HEVs e migrar através do endotélio para o estroma em cerca de 1 hora. A maioria se move dentro do estroma, enquanto outros migram para capilares linfáticos em cerca de 2-3 horas. A rotulagem de fluorescência bem desenvolvida neste estudo resultou em alta intensidade e nos permite observar a dinâmica do linfócito de área muito profunda. Além disso, usando um tipo diferente de rotulagem de fluorescência, podemos facilmente observar dinâmicas de diferentes tipos de linfócitos simultaneamente. Esta migração de linfócitos gut-tropic pode ser esclarecida visualmente para supressão por alguns imunomoduladores como o FTY720, como mostrado em nosso relatório anterior.
A observação do sistema microcirculatório em si é extremamente difícil, e é desejável estabelecer um método de avaliação fácil. Este estudo também possibilitou descobrir onde está o local de ação da droga nos patches do Peyer. Em particular, a administração ex vivo do FTY720 ao linfócito possibilitou limitar o local de ação apenas aos linfócitos, mas não ao endotélio. Combinados com a classificação de linfócitos específicos, resultados mais detalhados seriam obtidos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig1.jpg"> Figura 1: Procedimento para expor o ducto torácico e realizar a cannulação. Depois de cortar o peritônio longitudinalmente, o ducto torácico pode ser exposto movendo o estômago cranialmente e dissecando o tecido conjuntivo no lado direito dorsal da aorta abdominal. O tecido conjuntivo ao redor do diafragma deve ser cuidadosamente dissecado para evitar lesões. O ducto torácico deve ser exposto o mais largo cranialmente possível para criar espaço suficiente para a cannulação e, em seguida, ligado por uma sutura de seda 3-0 logo abaixo do diafragma para parar o fluxo de linfático e reter o fluido caudally. O fluido linfático leitoso é visível através do ducto linfático, onde o cateter pode ser inserido. O ducto torácico do rato deve ser ligeiramente tenso para garantir uma cannulação lisa. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61568/61568fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig2.jpg"> Figura 2: Imagem de todo o cenário para coleta de linfócitos torácicos (TDLs). Os ratos são mantidos nas gaiolas de Bollman e TDLs são coletados através do tubo de cannulação em cada frasco. Os frascos são colocados no gelo e substituídos a cada 12 horas para coletar fluido linfático fresco. A solução salina carregada de açúcar é administrada através de um tubo de silicone usando uma bomba de seringa a uma taxa de cerca de 3 mL/h para evitar a desidratação. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61568/61568fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig3.jpg"> Figura 3: O rato é colocado no estágio do microscópio conectado à máquina de anestesia, e uma substância fluorescente ou linfócitos fluorescentes são injetados do cateter venoso através da veia jugular interna(A). A área de observação do trato intestinal foi suavemente fixada entre duas bolas de algodão enroladas. O trato intestinal foi fixado longe do tronco para evitar vibração por movimentos respiratórios. Bolas de algodão laminadas foram encharcadas em soro fisiológico tamponado fosfato para evitar a secagem do intestino durante o período de observação(B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61568/61568fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig4.jpg"> Figura 4: Imagem microscópica das manchas de Peyer na condição fisiológica (A). Os núcleos das células endoteliais vasculares são manchados de azul. O plasma de sangue é vermelho, e o fluxo sanguíneo é detectado pelo fluxo de células não manchadas. Linfócitos gut-trópicos (verde manchado) aderindo a venules endoteliais elevados(B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61568/61568fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Aqui, descrevemos um método preciso para coletar linfócitos toráclicos e observar a migração de linfócitos gut-tropic nos patches de Rato Peyer por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo. Esta técnica pode esclarecer como a dinâmica dos linfócitos são afetadas em condições inflamatórias.

Observação microscópica da Dinâmica do Linfócito em Patches de Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K visualizações.  National Defense Medical College. Aqui, descrevemos um método preciso para coletar linfócitos toráclicos e observar a migração de linfócitos gut-tropic nos patches de Rato Peyer por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo. Esta técnica pode esclarecer como a dinâmica dos linfócitos são afetadas em condições inflamatórias.

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Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp in the Conscious Rat

Type 2 diabetes (T2D) is rapidly rising in prevalence. Characterized by either inadequate insulin production or the inability to utilize insulin produced, T2D results in elevated blood glucose levels. The "gold-standard" in assessing insulin sensitivity is a hyperinsulinemic-euglycemic clamp or insulin clamp. In this procedure, insulin is infused at a constant rate resulting in a drop in blood glucose. To maintain blood glucose at a constant level, exogenous glucose (D50) is infused into the venous circulation. The amount of glucose infused to maintain homeostasis is indicative of insulin sensitivity. Here, we show the basic clamp procedure in the chronically catheterized, unrestrained, conscious rat. This model allows blood to be collected with minimal stress to the animal. Following the induction of anesthesia, a midline incision is made and the left common carotid artery and right jugular vein are catheterized. Inserted catheters are flushed with heparinized saline, then exteriorized and secured. Animals are allowed to recover for 4-5 days prior to experiments, with weight gain monitored daily. Only those animals who regain weight to pre-surgery levels are used for experiments. On the day of the experiment, rats are fasted and connected to pumps containing insulin and D50. Baseline glucose is assessed from the arterial line and used a benchmark throughout the experiment (euglycemia). Following this, insulin is infused at a constant rate into the venous circulation. To match the drop in blood glucose, D50 is infused. If the rate of D50 infusion is greater than the rate of uptake, a rise in glucose will occur. Similarly, if the rate is insufficient to match whole body glucose uptake, a drop will occur. Titration of glucose continues until stable glucose readings are achieved. Glucose levels and glucose infusion rates during this stable period are recorded and reported. Results provide an index of whole body insulin sensitivity. The technique can be refined to meet specific experimental requirements. It is further enhanced by the use of radioactive tracers that can determine tissue specific insulin-stimulated glucose uptake as well as whole body glucose turnover.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp is the "gold standard" for the assessment of insulin action. Insulin is infused at a constant rate stimulating glucose uptake. The amount of exogenous glucose infused to counter this drop is indicative of insulin sensitivity. Here the procedure is performed on a conscious, unrestrained rat.

Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamp in the Rat Consciente

Type 2 diabetes (T2D) is rapidly rising in prevalence. Characterized by either inadequate insulin production or the inability to utilize insulin produced, ...

Medicina

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

Angiogênese no pulmão de rato Isquêmica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Método otimizado de LC-MS/MS para a análise do elevado-throughput de amostras clínicas de Ivacaftor, seus principais metabolitos e Lumacaftor em fluidos biológicos de pacientes de fibrose cística

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Implantation of hiPSC-derived Cardiac-muscle Patches after Myocardial Injury in a Guinea Pig Model

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss of relevant amounts of heart muscle mass can lead to the heart failure. Besides heart transplantation, there is no curative treatment option for the end-stage heart failure. In times of organ donor shortage, organ independent treatment modalities are needed. Left-ventricular assist devices are a promising therapy option, however, especially as destination therapy, limited by its side-effects like stroke, infections and bleedings. In recent years, several cardiac repair strategies including stem cell injection, cardiac progenitors or myocardial tissue engineering have been investigated. Recent improvements in cell biology allow for the differentiation of large amounts of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC). One of the cardiac repair strategies currently under evaluation is to transplant artificial heart tissue. Engineered heart tissue (EHT) is a three-dimensional in vitro created cardiomyocyte network, with functional properties of native heart tissue. We have created EHT-patches from hiPSC derived cardiomyocytes. Here we present a protocol for the induction of left ventricular myocardial cryoinjury in a guinea pig, followed by implantation of hiPSC derived EHT on the left ventricular wall.

Here we present a protocol for the induction of left ventricular cryoinjury followed by the implantation of a cardiac muscle patch, derived from human iPS-cell cardiomyocytes in a guinea pig model.

Implantação de Patches hiPSC-derivado do músculo cardíaco após lesão miocárdica em um modelo de cobaia

Due to the limited regeneration capacity of the heart in adult mammals, myocardial infarction results in an irreversible loss of cardiomyocytes. This loss ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Uma lesão de balão segmental controlada por pressão da artéria de rato com aplicação terapêutica periadventicional

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Acupuncture in a Rat Model of Asthma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes methods for the fabrication of the high platform, establishes a rat model of asthma and measures changes in respiratory function using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system.

Acupuntura em um modelo de rato de asma

A high platform can fix rats without restriction and completely expose the acupoints on the back during acupuncture manipulation. This article describes ...

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is currently the only treatment for life-threatening ventricular fibrillation. However, defibrillation may have side-effects, including intolerable pain, tissue damage, and worsening of prognosis, indicating a significant medical need for the development of more gentle cardiac rhythm management strategies. Besides energy-reducing electrical approaches, cardiac optogenetics was introduced as a powerful tool to influence cardiac activity using light-sensitive membrane ion channels and light pulses. In the present study, a robust and valid method for successful photostimulation of Langendorff perfused intact murine hearts will be described based on multi-site pacing applying a 3 x 3 array of micro light-emitting diodes (micro-LED). Simultaneous optical mapping of epicardial membrane voltage waves allows the investigation of the effects of region-specific stimulation and evaluates the newly induced cardiac activity directly on-site. The obtained results show that the efficacy of defibrillation is strongly dependent on the parameters chosen for photostimulation during a cardiac arrhythmia. It will be demonstrated that the illuminated area of the heart plays a crucial role for termination success as well as how the targeted control of cardiac activity during illumination for modifying arrhythmia patterns can be achieved. In summary, this technique provides a possibility to optimize the on-site mechanism manipulation on the way to real-time feedback control of cardiac rhythm and, regarding the region specificity, new approaches in reducing the potential harm to the cardiac system compared to the usage of non-specific electrical shock applications.

This work reports a method for controlling the cardiac rhythm of intact murine hearts of transgenic channelrhodopsin-2 (ChR2) mice using local photostimulation with a micro-LED array and simultaneous optical mapping of epicardial membrane potential.

Gerenciamento Avançado do Ritmo Cardíaco Aplicando Fotoestimulação Optogenética Multi-Site em Corações Murinos

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

The Microscopic Transcanal Approach in Stapes Surgery Revisited

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the external auditory canal, the middle ear, and epitympanon. Such an approach avoids a retroauricular or endaural skin incision; however, working through a narrow space needs angled microsurgical instruments and specific training in otologic surgery. The transcanal approach restricts the working space; however, it offers a binocular microscopic vision into the middle ear without extended skin incisions and thus, reducing post-operative pain and bleeding. In addition, this minimally invasive approach avoids scar tissue complications, hypoesthesia of the auricle, and potential protrusion of the pinna. Despite its numerous advantages, this method is still not routinely performed by otologic surgeons. Since this minimally invasive technique is more challenging, there is a need for extensive training in order for it to be widely adopted by otologic surgeons. This article provides step-by-step surgical instructions for stapes surgery and reports possible indications, pitfalls, and limitations using this microscopic transcanal technique.

This article describes the microscopic transcanal technique for stapes surgery, providing step-by-step surgical instructions for familiarizing surgeons with this approach.

A Abordagem Transcanal Microscópica na Cirurgia do Estribo Revisitada

The microscopic transcanal (aka transmeatal) surgical approach was first described in the 60s, offering a minimally invasive means of reaching the ...

Microscopic Replantation of Penile Glans Amputation Due to Circumcision

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans amputation, which is a very rare iatrogenic genital injury. Such complication is conventionally treated by simple hemostasis to achieve self-healing, early gross replantation, or delayed plastic surgery. However, these may lead to obvious unfavorable outcomes such as amputated glans loss, necrosis, malformation healing, or urethral orifice stenosis. In the present study, we adopted microscopic replantation as an emergency approach to achieve the precise anastomoses and anatomic reconstruction of penile glans. The goal of this protocol is to present a detailed emergency management strategy with meticulous surgical skills for the penile glans amputation. The postoperative results showed that the original shape of the glans was perfectly restored with satisfactory cosmetic appearance. The micturition function was completely restored to normal without any obvious complications. There was also no significant reduction in the sensation of amputated glans area. Hence, early meticulous microscopic replantation as soon as possible is an ideal emergency management strategy for the penile glans amputation due to circumcision.

The present protocol describes the emergency management of microscopic replantation of penile glans amputation due to circumcision.

Replantação microscópica da amputação de glans penianos devido à circuncisão

Circumcision using a disposable stapler is becoming quite popular in China. However, improper surgical procedures also bring the risk of penile glans ...

Microscopic Cyst Resection for the Treatment of Patients Diagnosed with Epididymal Cyst

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative asoedema, hematoma, sustaining pain, and seminal tract obstruction in patients who have undertaken nonmicroscopic epididymal cyst resection or epididymal resection. Nonmicroscopic epididymal cyst surgery is suggested for patients with childbirth plans as a precaution. The treatment of male epididymal cysts via microtechnology is obviously a beneficial option; we took the lead in carrying out microscopic epididymal exploration and cyst resection surgery in China. From September 2017 to April 2021, 41 young and middle-aged male patients diagnosed with epididymal cysts underwent microtechnology treatment in a program titled &#34;microscopic epididymal exploration and cystectomy&#34;. The postoperative follow-up lasted for 3-50 months. The results confirmed that, as microscopic manipulation largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis, the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact under the microscope. Bleeding during the operation was significantly reduced (2-3 mL) and wound drainage was not required. According to follow-up data, microscopic treatment significantly reduced the incidence of postoperative scrotal hematoma, edema, and long-term postoperative pain, thereby promising a higher surgical success rate as well as recurrence prevention. Besides, preliminary experience and reflection suggest that microscopic epididymal exploration and cystectomy provide efficient preservation of the epididymal patency through refined treatment, while a better prognosis can be achieved. We recommend that surgery be carried out before the epididymal cyst develops to 0.8 cm in diameter, for fear that a larger epididymal cyst (&#62;0.9 cm in diameter) could cause the complete destruction of all tubules of the ipsilateral epididymis - a more severe case with damage to the testicular output network.

Here, we present a protocol to treat patients diagnosed with an epididymal cyst using microscopic cyst resection. Based on microscopic manipulation, a largely improved visualization of the subtle tissue structures of the epididymis was obtained, so the cyst could be clearly dissected apart and completely removed intact.

Ressecção de Cisto Microscópico para Tratamento de Pacientes Diagnosticados com Cisto Epididimal

Epididymal cysts mostly occur in men aged 20-40 years old. Previous reports have covered concerns about postoperative complexes, including postoperative ...