Este estudo foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e Canada.JS Genoma detém concessões salariais apoio da Foundationfor Heritage Alberta Pesquisa Médica, Heart and Stroke Foundation do Canadá e da Associação de Diabetes do Canadá. Um agradecimento especial ao Dr. David Wasserman e Bracy Bingle para ensinar este procedimento para o laboratório Shearer.

A: Cateterismo Cirúrgica da circulação arterial e venosa Parte 1: arterial e venoso Preparação Cateter <ol><li> Cortar 15 cm de PE-50 (diâmetro interno de 0,58 milímetros (0,023 &quot;) x um diâmetro exterior de 0,965 milímetros (0,038&quot;). Corte uma seção de tubo de silastic um milímetro (0,76 mm (0,030 &quot;) de diâmetro interno x 1,65 milímetros (0,065 &quot;) de diâmetro externo) para uso como restrição do grânulo. O talão de restrição impede o rato de retirar o cateter, uma vez que está no lugar. </li><li> Inserir as pontas dos micro pinças de dissecação para o lúmen do talão de restrição e gentilmente segure as pontas das pinças para além de esticar a abertura maior. Usando um outro par de pinças de dissecação micro, deslize o tubo silastic para o lúmen do talão de restrição. Fixe com cola adesiva forte (Loctite Super Glue). O talão deve ficar na posição horizontal ao redor do cateter. Permitir cateter para secar (24 horas). </li><li> Para um rato grama 300, a linha arterial é de aproximadamente 2,7 centímetros do talão de restrição enquanto a linha de jugular é de aproximadamente 3,2 centímetros. Comprimentos cateter da restrição são ajustados por 0,5 centímetros para cada aumento de 100 g no peso corporal. Não chanfro nas bordas do cateter, pois isso pode punção do vaso durante a inserção. </li><li> Imediatamente antes da cirurgia, preencher as linhas com salina heparinizada (10U/ml), selo ambas as extremidades com um plug em aço inoxidável tubos e colocar em etanol (70%) para esterilizar. Ar seco antes da inserção. </li></ol> Parte 2: Preparação Cirúrgica <ol><li> Procedimentos foram aprovados pela Universidade de Calgary e Animal Care Use Comitê e respeitar Canadian Association for Laboratory Animal Ciência diretrizes para a experimentação. Os procedimentos descritos abaixo foram realizados em adultos, machos Sprague-Dawley (~ 300g). Todos os procedimentos são realizados sob isoflurano, embora seja possível a utilização de anestésicos injetáveis. Todos os procedimentos cirúrgicos são realizados assegurando técnicas assépticas. Equipamento cirúrgico, copos e salina heparinizada são esterilizados em autoclave. Luvas cirúrgicas, seringas e aplicadores de algodão esterilizado ponta são comprados do fornecedor. </li><li> Pesar o rato e gravar o resultado. O peso será importante no acompanhamento pós-cirúrgico de animais. Únicos animais que recuperar o peso pré-operatório os níveis devem ser utilizados para a experimentação. Anestesiar ratos (3% isoflurano) em uma caixa de anestésico. Mantenha o rato em ~ isoflurano a 2% durante a cirurgia usando um cone de nariz. Cirurgia deve ser realizada em uma área que promove a desinfecção assepsia. </li><li> Prepare o animal através da remoção do cabelo do sítio cirúrgico (pescoço e ombros). A máquina de cortar cabelo pequeno ou depilatórios químicos podem ser usados. Executar este procedimento em uma área separada onde a cirurgia deve ser realizada. </li><li> Seguro de animais para a mesa cirúrgica. Garantir animal é completamente anestesiados, verificando a presença de pé / olho reflexos. Preparar os locais cirúrgicos com um desinfectante da pele adequada (etanol 70%, seguido pelo matagal betadine seguido por etanol 70%). </li></ol> Parte 3: Cirurgia <ol><li> Faça pequenas 1 centímetro incisão vertical na linha média superior à do esterno (Pick up da pele ao longo do eixo longitudinal medial com uma pinça e cortado com tesoura ou bisturi). </li><li> Blunt dissecar usando micro pinças de dissecação para expor o músculo esternocleidomastóideo esquerdo. Refletir este músculo para expor cerca de um centímetro da artéria carótida esquerda. Use uma pinça de dissecação com micro artéria carótida para manter a artéria no local. Suavemente provocar off tecido conjuntivo da artéria carótida. É importante isolar o nervo vago da artéria sem danificar tanto a artéria ou nervo. Isolar a artéria, em seguida, ligadura final cefálica com fio de seda 4-0 (este será usado para manipular a artéria carótida durante a cirurgia). Nota: 4-0 devem ser esterilizados com álcool 70% antes do uso. </li><li> Prender o recipiente com serrilhados, micro dissecação fórceps. Punção no final ligada com um calibre 21 Adaptador Luer VENOJECT Multi-Sample. Remova o plugue de tubos de aço inoxidável e insira cuidadosamente cateter com a ajuda de um introdutor de cateter estéril para admiti-lo para dentro da artéria. Assegurar o cateter é seguro com uma pinça, parcialmente liberação micro pinças de dissecação clampeamento da artéria e continuar inserindo o cateter para o talão. Neste ponto, a ponta do cateter deve ser no arco aórtico. Tome cuidado para não liberação do cateter, a pressão do navio irá forçá-lo para fora. </li><li> Amarre dois 4-0 com segurança abaixo de contas e um acima e confirmar que o cateter irá amostra. Lavar o sistema com solução salina heparinizada 10U/ml. Re plug-final da externa do cateter com uma ficha de tubos de aço inoxidável. </li><li> Usando a mesma incisão, sem corte para expor dissecar veia jugular externa direita. Isolar cuidadosamente e ligar o final cefálica com fio de seda. Puncionar a veia com uma calibre 21 Adaptador Luer VENOJECT Multi-Sample. Remova o plugue de tubos de aço inoxidável e inserir cateter com c estérilintrodutor atheter para o talão e gravata duas suturas abaixo do talão. Amarre uma sutura terceiro talão acima e confirmar que as amostras. Nivelada com a linha venosa 10U/ml heparinizado salina. Re plug-final cateter externo com tomada de tubos de aço inoxidável. </li><li> Túnel de calibre 14 com agulha sob a pele sem corte e fazer a incisão nas costas entre as omoplatas. Passe o cateter através da agulha para exteriorizar-los na parte de trás do rato. Cerca de quatro centímetros da linha é visível. Corte de 0,5 centímetros Tygon Tubulação Medical S-50-HL, colocá-lo em torno de ambos os cateteres exteriorizados e seguro com uma fita como requerido (azul para a veia, vermelho para artéria). Reteste cateteres para assegurar a permeabilidade, lavar e encher com solução salina heparinizada 150U/ml para prevenir a coagulação. </li><li> Feche todas as incisões com fio de seda 3-0. Ratos propensos lugar, em pré-aquecido gaiola, limpa com comida no fundo da gaiola. </li></ol> B: Cuidados Pós-Operatórios Parte 1: Cuidados pós-operatório imediato e Monitoramento <ol><li> Quando o rato recupera capacidade ambulatorial completa e alerta devolver o rato para alojamento dos animais. </li><li> Permitir o rato para recuperar para 3-5 dias. </li><li> Monitorar diariamente para infecção, dor e alterações no peso. A infecção pode ser motivo de preocupação se a descarga de sites da incisão, letargia geral e / ou dor é observado. A dor é indicado por postura encurvada, pele volta babados e ausência de comportamento ambulatorial e / ou comer. A perda de peso pode ser experimentado imediatamente após a cirurgia até três dias após a cirurgia, no entanto, o peso deverá estabilizar e / ou aumento de até 10% do peso pré-cirúrgico dentro de 5 dias. Severa perda de peso pode indicar acidente vascular cerebral, infecção e / ou dor. </li><li> Reteste cateteres diariamente para garantir a permeabilidade. </li></ol> Parte 2: Manter permeabilidade do cateter <ol><li> A cada dia durante o pós-operatório de recuperação, preencha Seringas Dica 1ml SLIP com salina heparinizada 150U/ml e tampá-lo com uma agulha de calibre 22 sem corte. A agulha é inserida blunt 20cm de tubo PE-50 com 23 tubos de engate gauge de aço inoxidável na outra extremidade. </li><li> Remover bolhas de ar, colocando a extremidade com o acoplador de tubos maior do que o resto da seringa de 1ml e empurrar as bolhas para fora da linha. </li><li> Grampo fora da linha arterial exteriorizada a partir do rato com hemostats logo abaixo a ficha. </li><li> Remova o plugue de cateter de aço usando o segundo par de hemostats. </li><li> Insira o acoplador de tubos ligados à seringa na linha arterial e solte o hemostats oclusão do cateter exteriorizada arterial. </li><li> Aspirar o sangue arterial do cateter para a seringa. Se o cateter não chamar a facilidade com que pode ser necessário muito gentilmente empurrar uma pequena quantidade de solução de descarga através do cateter para desalojar a ponta do cateter no caso, é prensada contra a parede do vaso. O cateter foi completamente apagado quando o sangue chega a seringa. </li><li> Prender a próxima PE-50 tubulação para a seringa de 1ml e descarte da seringa. Substituir por uma nova seringa preenchida com soro fisiológico 150U/ml fresco heparinizado. Unclamp a tubulação e segurando a seringa na posição vertical novos, flick a nova seringa com o dedo para retirar eventuais bolhas de ar novo para cima e para longe da linha. Nota: Cuidado deve ser assegurada como bolhas de ar podem causar um derrame. </li><li> Injetar o soro fisiológico 150U/ml heparinzed até a linha de cateter é clara e livre de sangue. </li><li> Grampo fora da linha arterial exteriorizada a partir do rato com hemostats logo abaixo do acoplador tubulação. Remova o conector da seringa partir da linha de cateter arterial e substituí-la com a ficha de aço inoxidável da tubulação. </li><li> Solte o hemostats oclusão do cateter exteriorizada arterial. </li><li> Repita o procedimento para linha venosa. No entanto, devido a amostragem de baixa pressão venosa muitas vezes não é possível. Se a solução salina 150U/ml heparinzed pode ser infundido com resistência mínima é provável que o cateter está bem posicionado na veia. </li></ol> C: hiperinsulinêmico euglicêmico-Grampo Parte 1: Pinça de Set-up e Preparação <ol><li> Pesar o rato e registrar o peso. Esta será necessária para determinar as taxas de infusão de insulina e glicose. Rápido o rato por pelo menos 5h antes de experimentar. Isso garante que o animal está em um estado pós-prandial ea contribuição de glicose a partir de fontes alimentares é minimizado. Coloque o rato em um pequeno recipiente / gaiola com roupa de cama, que limita o movimento excessivo. O animal deve ser capaz de virar-se eo noivo livremente. </li><li> Criar linhas e bombas de infusão, como visto na Figura 1. P50 comprimentos de mangueira de ligação são as seguintes: seringa para Y conector é de 8 cm, Y conector para rato é 15cm, linha arterial é 20cm, e linha venosa é 10 centímetros de comprimento. Remova os bujões de tubos de aço inoxidável e lave as linhas arterial e jugular para garantir a infusão e amostragem, respectivamente, com solução salina heparinizada 10U/ml. </li><li> Determinar à insulina<html> volume necessário. Isso vai variar dependendo do nível de insulina e peso do rato. Aqui, 4mU/kg/min é administrada a uma taxa de 2uL/min. Esta é uma alta dose fisiológica. Sempre que possível, devem ser feitas tentativas para limitar o volume de infusão. Insulina deve ser adequadamente diluída e ser administrada na presença de plasma. Uma solução a 3% do plasma de rato em solução salina é utilizada para diluir a insulina neste laboratório. A insulina é HumulinR 100U/ml (Eli Lily), embora insulina de acção rápida outras podem ser empregadas. Certifique-se de insulina diluída é bem misturado antes de colocar em seringa de infusão. </li><li> Prepare dextrose 50%. Isto pode ser colocado diretamente em seringa na bomba de infusão. Mark bomba com &quot;glicose&quot; para evitar futuras confusões. Lembre-se de garantir volumes suficientes de insulina e glicose para o estudo. Grampos geralmente duram ~ 2h. No presente protocolo, seringas de 3 ml são usados. </li><li> Glucose lugar e seringas de insulina em Harvard Apparatus modelo 11 Plus bombas de seringa. Glucose avançar para Y Conector de linha e com uma pinça hemostática. Insulina avançar para animal, clamp linha com hemostat. Grampo linhas e permitem rato para relaxar por 30min antes de iniciar o experimento. NOTA: guardas ponta hemostat são sugeridas para evitar permanente cravação das linhas. </li><li> Prepare centrífuga e EDTA-tubos revestidos para a coleta de plasma. No presente estudo, amostras de sangue adicionais serão obtidos quando o animal está preso. </li></ol> Parte 2: Protocolo Experimental <ol><li> Uma amostra de insulina basal e amostra de hematócrito devem ser adquiridos. Amostragem hematócrito garante volume de sangue é mantida durante todo o experimento. Geralmente, os níveis de hematócrito não devem cair mais de 10% do valor inicial. </li><li> Obter uma amostra de glicose basal (One Touch Ultra, LifeScan, Inc.) e determinar o nível de glicose no sangue total a ser clipado. Aqui, nós braçadeira em euglicemia, ou 5,0 5,5 mM (Figura 2). Depois de cada amostra de sangue, lave linha arterial com um pequeno volume de solução salina heparinizada 10U/ml para prevenir a coagulação. NOTA: Certifique-se sem coágulos ou bolhas de ar estão na linha antes da infusão. Estes podem dar o animal de um derrame. </li><li> Iniciar infusão de insulina. Tomar glicose no sangue em intervalos de 5-10min, o monitoramento de glicose em cada momento. Ajustar a taxa de glicose de infusão conforme necessário até que um estado de equilíbrio é alcançado. Este processo é geralmente um processo de tentativa e erro e pode levar 30min a&gt; 2h. Os níveis de glicose necessária para manter a glicemia são dependentes do protocolo experimental, as espécies e as condições atuais (Figura 2). </li><li> Os níveis de glicose no estado estacionário são três leituras consecutivas dentro de um intervalo definido. Aqui, dentro de três leituras ~ 1mM é considerado apertado (por exemplo, 4.8, 5.2, 5.6mm). Uma vez que o estado estacionário é atingido, a taxa recorde infusão de glicose necessária para manter a glicemia por um período de 30min. Durante este tempo as amostras de sangue adicionais podem ser obtidas. No mínimo, uma amostra de insulina plasmática e segunda amostra de hematócrito deve ser obtida. </li><li> Uma vez que grampo é concluída, os animais podem ser usadas para outros testes ou sacrificados e os tecidos coletados para análise posterior. Dependendo do animal, linhas de cateter pode ficar patente durante 5-7 dias. </li></ol> D: hiperinsulinêmico euglicêmico-Resultados (insulina) Grampo Quando realizada corretamente, o procedimento de fixação avalia a sensibilidade à insulina no estado de equilíbrio do rato. Ao apresentar os dados obtidos a partir da braçadeira, é essencial para documentar os níveis de glicose e as taxas de infusão de glicose. Os níveis de glicose estáveis ​​ao longo do tempo um curso de um mínimo de 30min (Figura 3) são indicativos de um estado estacionário. A glicose é considerado estável somente se glicose no sangue total é mantido dentro de ~ 1mm. Taxas de infusão de glicose mostram os níveis de glicose exógena necessária para manter a glicemia. Sempre que possível, estes valores devem ser mostrados como um curso de tempo ao invés de valor único, em média (Figura 4). Outras medidas recomendadas para serem relatados são insulina plasmática e do hematócrito. A determinação do jejum e os níveis de insulina preso confirmar que a insulina foi administrada com sucesso e irá detectar eventuais diferenças de níveis entre os grupos de tratamento (Figura 5). Medidas de hematócrito no início e obter a conclusão do clamp de insulina são sugeridos (Figura 6). Isso é para garantir os níveis de hematócrito não caem mais de 5% durante o experimento e as alterações que acompanham no volume de fluxo sanguíneo e não influenciam a disponibilidade de glicose. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Experimental set-up. A Figura 1 mostra rato, desenfreada consciente durante o procedimento de fixação. Cateteres permitir a amostragem de sangue e infusões sem manipulação do animal. Bombas à esquerda contêm insulina e glicose. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esperados dados durante o processo de fixação. Para obter uma braçadeira em níveis basais (euglicemia, 5mM), os níveis de glicose exógena (D50) são manipulados até a linha de base ou &#39;grampo&#39; é alcançada. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Resultados esperados plasma glucose do procedimento de fixação. Quando o animal é &#39;preso&#39;, de glicose no sangue é relativamente estável ao longo do tempo e os grupos experimentais. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig4.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 4. Taxas de glicose Representante infusão do procedimento de fixação. A quantidade de glicose exógena necessária para manter a euglicemia difere. Isto é ilustrado com um controle (ração alimentar) e alto teor de gordura alimentados (resistentes à insulina) animais. A alta de gordura animal alimentado requer menos glucose injectada para manter a glicemia, principalmente porque ele é insensível à insulina infundida. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Insulina plasmática Representante do rato. A insulina plasmática durante o clamp de insulina deve ser maior do que o jejum de insulina plasmática, linha de base. Isso garante a insulina foi devidamente administrada ao animal durante o clamp de insulina. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Relato de hematócrito. O hematócrito inicial e hematócrito após a experiência deve ser obtida e relatada. Isso garante níveis de hematócrito não caem mais de 5% dos níveis basais decorrentes da amostragem excessiva de sangue arterial.

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Procedimentos foram aprovados pela Universidade de Calgary e Animal Care Use Comitê e respeitar a Associação Canadense de orientações Laboratory Animal Science for experimentação. Os autores não têm interesses conflitantes ou divulgações.

Inicialmente desenvolvido para a investigação da sensibilidade à insulina em seres humanos, o procedimento de fixação foi agora adaptada para outras espécies, incluindo ratos de laboratório e camundongos. Modelos animais de resistência à insulina investigando fornece uma ajuda significativa para a compreensão da fisiopatologia da sensibilidade à insulina e patologias associadas, bem como identificar as intervenções terapêuticas que têm valor clínico 1,2. Vários métodos para avaliar a sensibilidade à insulina em animais têm sido empregadas 3. Tais técnicas incluem variações de testes de tolerância à glicose (GTTs) e testes de tolerância à insulina (ITTS) 06/04, bem como índices de sensibilidade à insulina / resistência derivada de jejum condições de estado estacionário 7-9. No entanto, quando a sensibilidade à insulina é o principal objectivo experimental e viabilidade técnica não é limitar o clamp de insulina continua sendo o padrão. Aqui apresentamos o procedimento de fixação mais básico no rato, consciente desenfreada. A insulina é administrada a uma taxa constante enquanto a glicose exógena variável é injectada para manter a glicemia. Acesso à circulação do animal é obtido através do implante de cateteres arterial e jugular. Como o estresse animal (handling) e fluxo de glicose anestesia alterar e sensibilidade à insulina, um modelo que minimiza esses fatores é favorecido e utilizado neste procedimento. O grampo de insulina é comumente usado em diabetes, investigações cardiovascular e farmacêutica. Modificações ao procedimento incluem a adição de traçadores isotópicos (radioativos ou estáveis). Estes são poderosos que permitem que o investigador para determinar como os tecidos específicos e vias bioquímicas são alterados em resposta ao grampo. Isótopos comuns incluem o uso de 2 - [14C]-deoxiglicose para examinar todo o corpo e tecido a disponibilidade de glicose específicos, bem como [3H]-glicose para a medição do fluxo de glicose. Excelentes críticas de questões metodológicas e elaboração de relatórios ao executar o procedimento de fixação de insulina por Wasserman et al. 10,11 são altamente recomendados.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr valign="top"><td> Tubos de polietileno Intramedic (PE-50) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-170-12B </td><td> Diâmetro interno de 0,58 milímetros (0,023 &quot;) x diâmetro externo de 0,965 milímetros (0,038&quot;) </td></tr><tr valign="top"><td> Dow Corning Tubing Laboratório Silastic </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-189-15C </td><td> Diâmetro interno de 0,76 milímetros (0,030 &quot;) x diâmetro externo de 1,65 milímetros (0,065&quot;) </td></tr><tr valign="top"><td> Tygon S-50-HL Tubulação de Medicina </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PY2 72-1251 </td><td> Diâmetro interno de 3.2mm (0.125 &quot;) x 4,7 milímetros de diâmetro exterior de (0,1875&quot;) </td></tr><tr valign="top"><td> Loctite Super Glue </td><td> Grand &amp; Toy </td><td> 32237 </td><td> Gel de Controle </td></tr><tr valign="top"><td> Lâmina cirúrgica estéril </td><td> VWR </td><td> BD371610 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Micro Pinça curva Dissecting </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 160-20 </td><td> x 2 </td></tr><tr valign="top"><td> Micro Pinça reta Dissecting </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 160-15 </td><td> x 2 </td></tr><tr valign="top"><td> Hemostática curva </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 105-1135 </td><td> x 2 </td></tr><tr valign="top"><td> Hemostática reta </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 105-1130 </td><td> x 2 </td></tr><tr valign="top"><td> Dica Guarda hemostat </td><td> Robbins Instruments, Inc. </td><td> 15.09-2-004 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Tesoura reta Cirurgia </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 105-402 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> VENOJECT Multi-Sample Luer Adapter </td><td> Terumo Medical Products </td><td> 810127A </td><td> 21 gauge, 1 pol </td></tr><tr valign="top"><td> Introdutor do cateter estéril </td><td> Becton Dickinson </td><td> 406999 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 14-gauge agulha Blunt </td><td> Becton Dickinson </td><td> 511310 </td><td> Calibre 14, 2 pol </td></tr><tr valign="top"><td> Sutura cirúrgica estéril </td><td> Johnson &amp; Johnson Medical Products </td><td> 1679H </td><td> Seda, tamanho 3-0 </td></tr><tr valign="top"><td> Não-esterilizadas suturas cirúrgicas </td><td> Angiotech Pharmaceuticals, Inc. </td><td> SP116 </td><td> Seda, tamanho 4-0 </td></tr><tr valign="top"><td> Cotonetes de algodão </td><td> VWR </td><td> 10806-005 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 4ply compressas de gaze </td><td> VWR </td><td> CA43845-062 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Pequenos animais Clippers sem fio </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 729063 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Isoflurano </td><td> Halocarbon Products Corp </td><td> IPN-45 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Anestésico Carrinho </td><td> Benson Medical Industries, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Etanol 70% </td><td> Fisher Scientific </td><td> HC-1000 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Betadine solução anti-séptica </td><td> Drogas ocidental Distribution Centre Ltd. </td><td> 105267 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Modelo 11 Plus bomba de seringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 702208 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Tubos de aço inox Engates </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 72-4434 </td><td> 23 gauge, 0,3 polegadas </td></tr><tr valign="top"><td> Tubulação de aço inoxidável Plugs </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 72-4436 </td><td> 23 gauge, 0,5 pol </td></tr><tr valign="top"><td> Stainless Steel Needles Blunt </td><td> Instech Laboratories, Inc. </td><td> LS22 </td><td> Calibre 22 </td></tr><tr valign="top"><td> 60 Grau Y-Conectores </td><td> Peças pequenas </td><td> STCY-22-05 </td><td> Calibre 22 </td></tr><tr valign="top"><td> CritSpin Centrífuga Micro-hematócrito </td><td> Iris processamento das amostras </td><td> CS12 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Mini Centrífuga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-090-100 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Micro Tubos da centrífuga </td><td> VWR </td><td> 53550-778 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 50ml centrifugar tubos de polipropileno </td><td> VWR</td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Dica 1ml Seringas de plástico deslizamento </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Seringas 3ml Dica plástico Luerlok </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Injeção de anticoagulante heparina </td><td> Drogas ocidental Distribution Centre Ltd. </td><td> 102824 </td><td> Fabricante: LEO Pharma Inc. Conc. 1000 UI </td></tr><tr valign="top"><td> Solução EDTA </td><td> Promega Corp </td><td> V4231 </td><td> 0,5 M, pH 8,0 </td></tr><tr valign="top"><td> Salina </td><td> Drogas ocidental Distribution Centre Ltd. </td><td> ABB7983154 </td><td> Fabricante: Hospira Cloreto de Sódio 0,9% </td></tr><tr valign="top"><td> Dextrose 50% </td><td> Vetoquinol </td><td> 8DEX012D </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Humulin-R </td><td> Eli Lilly </td><td> HI-210 </td><td> 100U/ml </td></tr><tr valign="top"><td> 1ml seringas de insulina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309311 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Fisherbrand Selante * Hemato-Seal </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-678 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Fisherbrand * Tubos capilares de microhematócrito </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-362-574 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> One Touch Ultra tiras de teste </td><td> LifeScan, Inc. </td><td> AW 085-314H </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> One Touch Ultra medidor de glicose do sangue </td><td> LifeScan, Inc. </td><td> AW 085-314.oB </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Sódio Pentobarbitol </td><td> Ceva Sante Animale </td><td> 1715 138 </td><td> Conc. 54.7mg/ml </td></tr><tr valign="top"><td> Red Tape Labeling Laboratório </td><td> VWR </td><td> 89097-932 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Fita azul Etiquetagem de Laboratório </td><td> VWR </td><td> 89097-936 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Pesar Escala </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-913-88 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Vórtice </td><td> VWR </td><td> 58815-234 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Cronômetro </td><td> VWR </td><td> 62344-641 </td><td></td></tr></tbody></table>

hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat

Diabetes tipo 2 (diabetes tipo 2) está crescendo rapidamente na prevalência. Caracterizada por uma produção inadequada de insulina ou a incapacidade de utilizar a insulina produzida, os resultados T2D em níveis elevados de glicose no sangue. O &quot;padrão-ouro&quot; na avaliação da sensibilidade à insulina é um clamp hiperinsulinêmico euglicêmico-clamp ou insulina. Neste procedimento, a insulina é administrada a uma taxa constante, resultando em uma queda da glicose no sangue. Para manter a glicose no sangue a um nível constante, glicose exógena (D50) é infundida na circulação venosa. A quantidade de glucose injectada para manter a homeostase é indicativo de sensibilidade à insulina. Aqui, mostramos o procedimento de fixação básica na cronicamente cateterizada, rato, desenfreada consciente. Este modelo permite que o sangue a ser coletado com o mínimo de stress para o animal. Após a indução da anestesia, a incisão é feita na linha média e da artéria carótida comum esquerda e veia jugular direita são cateterizados. Cateteres inseridos são lavados com salina heparinizada, então exteriorizado e seguro. Animais são permitidos para se recuperar para 4-5 dias antes do experimento, com ganho de peso monitorados diariamente. Apenas os animais que recuperar o peso de pré-cirurgia níveis são utilizados em experiências. No dia do experimento, os ratos estejam em jejum e conectado a bombas contendo insulina e D50. Glucose linha de base é avaliada a partir da linha arterial e usou uma referência durante todo o experimento (euglicemia). Depois disso, a insulina é administrada a uma taxa constante para a circulação venosa. Para combinar com a queda da glicose no sangue, D50 é infundida. Se a taxa de infusão D50 é maior do que a taxa de absorção, um aumento da glicose irá ocorrer. Da mesma forma, se a taxa é insuficiente para atender a absorção de glicose do corpo inteiro, uma queda irá ocorrer. Titulação de glicose continua até que as leituras de glicose estáveis ​​são alcançados. Os níveis de glicose e as taxas de infusão de glicose durante este período estável são registrados e relatados. Resultados fornecem um índice de sensibilidade de todo o corpo à insulina. A técnica pode ser refinada para atender às necessidades específicas experimental. Ela é reforçada pelo uso de traçadores radioativos que podem determinar tecidos específicos de insulina estimulou a captação de glicose, bem como volume de negócios de glicose do corpo inteiro.

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Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp in the Conscious Rat

O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-é o &quot;padrão ouro&quot; para a avaliação da ação da insulina. A insulina é infundida a uma taxa constante estimulando a captação de glicose. A quantidade de glicose exógena infundido para combater essa queda é um indicativo de sensibilidade à insulina. Aqui, o procedimento é realizado em um rato, consciente desenfreada.

Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamp in the Rat Consciente

Type 2 diabetes (T2D) is rapidly rising in prevalence. Characterized by either inadequate insulin production or the inability to utilize insulin produced, ...

hyperinsulinemic-euglycemic-clamp-in-the-conscious-rat

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

51.9K visualizações.  University of Calgary. O grampo hiperinsulinêmico euglicêmico-é o "padrão ouro" para a avaliação da ação da insulina. A insulina é infundida a uma taxa constante estimulando a captação de glicose. A quantidade de glicose exógena infundido para combater essa queda é um indicativo de sensibilidade à insulina. Aqui, o procedimento é realizado em um rato, consciente desenfreada.

Vídeo: Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp in the Conscious Rat

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

Hiperinsulinêmico euglicêmico-Clamps em Consciente, Ratos Unrestrained

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

Medicina

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

Angiogênese no pulmão de rato Isquêmica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

De liberação lenta Drug Delivery através Elvax 40W para o Rat Retina: implicações para o tratamento de condições crônicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

Cateterismo da artéria carótida e jugular para executar as medidas hemodinâmicas, infusões e Sangue de amostragem em um Rat Consciente Modelo

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Avaliação transcutânea da função renal em roedores conscientes

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

A fibrose do fígado Modelo dimetilnitrosamina induzida no Rato

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ischemia/reperfusion (I/R) injury with myriad negative consequences. Potential I/R injury in marginal organs destined for liver transplantation contributes to the current donor shortage secondary to a decreased organ utilization rate. A significant need exists to explore hepatic I/R injury in order to mediate its impact on graft function in transplantation. Rat liver hilar clamp models are used to investigate the impact of different molecules on hepatic I/R injury. Depending on the model, these molecules have been delivered using inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injection, intravenous administration or injection into the peripheral superior mesenteric vein. A rat liver hilar clamp model has been developed for use in studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating I/R injury. The described model for rat liver hilar clamp includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic hepatic segment via a side branch of the portal vein, allowing for direct segmental hepatic delivery. Our approach is to induce ischemia in the left lateral and median lobes for 60 min, during which time the substance under study is infused. In this case, pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD), a free radical scavenger, is infused directly into the ischemic segment. This series of experiments demonstrates that infusion of PEG-SOD is protective against hepatic I/R injury. Advantages of this approach include direct injection of the molecule into the ischemic segment with consequent decrease in volume of distribution and reduction in systemic side effects.

A unique rat liver hilar clamp model was developed for studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating ischemia-reperfusion injury. This model includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic liver segment via a branch of the portal vein, allowing for direct hepatic delivery.

Método de entrega directa segmentos intra-hepática Usando um modelo de rato Liver Hilar Grampo

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. To better understand the mechanism behind these surgical procedures, a rat partial liver transplantation (PLTx) model was established for relevant surgical studies. Because of the complexity of the rat PLTx model, a protocol with detailed descriptions is required. An article published previously reported a protocol in which ex vivo hepatectomy was used to achieve 50% rat PLTx. In contrast to this protocol, we introduced a re-arterialized PLTx with an in vivo 70% hepatectomy. An updated vessel-oriented hepatectomy was incorporated into the rat PLTx to refine the microsurgical procedure. The portal veins and hepatic arteries of the left lateral lobe and the median lobe were individually dissected and ligated before removal of the liver parenchyma, thereby decreasing the probability of bleeding in the remnant liver stump. Furthermore, an end-to-side vessel anastomosis between the common hepatic artery and the enlarged proper hepatic artery was introduced to re-arterialize the hepatic artery. By using this end-to-side vessel anastomosis technique, the diameter of the anastomosis was enlarged, thereby decreasing the difficulty of hand suture and maintaining a high rate of anastomotic patency. Moreover, the cuff anastomosis of the infrahepatic vena cava was slightly modified. A section of circumferential liver parenchyma around the vena cava of a recipient was preserved during cuff anastomosis to maintain the three-dimensional shape of the vascular lumen. This section of liver parenchyma was removed after completing the anastomosis. With this modification, the step involving placement of stay sutures was omitted, thereby further shortening the cuff anastomosis time. By using this protocol of rat PLTx, a low liver enzyme level, an intact liver lobular architecture and a high survival rate were achieved after microsurgery.

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Here, a protocol involving re-arterialized rat partial liver transplantation is presented. Specifically, 70% liver was resected in vivo by using an updated technique of vessel-oriented hepatectomy. The hepatic artery was reconstructed in an end-to-side manner. The cuff technique was modified to shorten the anastomosis time of the infrahepatic vena cava.

Re-Arterialized transplante de fígado parcial de rato com na vivo orientado a embarcação 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

Avaliação da função respiratória em ratos conscientes por pletismografia dobro-câmara

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease and arrhythmias in people with epilepsy (i.e., epileptic heart.) Additionally, cardiac and autonomic disturbances have been reported surrounding seizures. 1:1,000 epilepsy patients/year die of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). The mechanisms for SUDEP remain incompletely understood. Electroencephalograms (EEG) and electrocardiograms (ECG) are two techniques routinely used in the clinical setting to detect and study the substrates/triggers for seizures and arrhythmias. While many studies and descriptions of this methodology are in rodents, their cardiac electrical activity differs significantly from humans. This article provides a description of a non-invasive method for recording simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography in conscious rabbits. As cardiac electrical function is similar in rabbits and humans, rabbits provide an excellent model of translational diagnostic and therapeutic studies. In addition to outlining the methodology for data acquisition, we discuss the analytical approaches for examining neuro-cardiac electrical function and pathology in rabbits. This includes arrhythmia detection, spectral analysis of EEG and a seizure scale developed for restrained rabbits.

Using simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography, we developed a methodology to evaluate the susceptibility of rabbit models to develop provoked arrhythmias and seizures. This novel recording system establishes a platform to test the efficacy and safety of therapeutics and can capture the complex cascade of multi-system events that culminate in sudden death.

Monitoramento multissuso para identificação de convulsões, arritmias e apneia em coelhos conscientes contidos

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...