Agradecemos a Kosuke Yusa por compartilhar os plasmídeos pMCS-AAT_PB-PGKpuroTK e pCMV-hyPBase. Agradecemos a Jia-Yin Yang e Karamjit Singh-Dolt por discussões úteis sobre a edição do genoma. O laboratório D.C.H. é apoiado por um prêmio do Chief Scientist Office (TC/16/37) e da Plataforma de Medicina Regenerativa do Reino Unido (MR/L022974/1). Y.W. foi apoiado por uma bolsa de doutorado financiada pelo Conselho Chinês de Bolsas de Estudo e pela Universidade de Edimburgo.

1. Projetando e construindo plasmídeos de expressão CRISPR/Cas9n-sgRNA
<ol><li>Procure por sequências de guia de 20 pb diretamente a montante de qualquer 5'-NGG perto do local a ser modificado. Um par de RNAs de guia única (sgRNAs) é necessário quando a Cas9 nickase (Cas9n) de Streptococcus pyogenes é usada. O par de sgRNAs deve ser capaz de gerar saliências de 5' ao cortar com um deslocamento de -4 a 20 pb6.</li>
	<li>Ordem oligos necessários e vetor pSpCas9n-2A-puro.</li>
	<li>Clone sgRNA no vetor pSpCas9n para co-expressão com Cas9n seguindo o protocolo publicado12.</li>
</ol>2. Projetando e construindo um vetor de segmentação baseado em piggyBac
<ol><li>Baixe a sequência do gene alvo e procure um site TTAA perto do local a ser modificado. NOTA: A distância entre o site TTAA e o site a ser modificado deve ser a menor possível. Se dentro da sequência de codificação e nenhum sítio TTAA estiver presente dentro de uma distância de 100 pb, é necessário introduzir um fazendo substituições de nucleotídeos sinônimos.</li>
	<li>Projetar braços de homologia (AHs) e incorporar mutações pontuais desejadas nos HAs. O comprimento ideal dos AHs deve ser de cerca de 500 - 1200 pb. NOTA: Recomenda-se introduzir substituições de nucleotídeos sinônimos para mutar a sequência PAM, a fim de evitar uma potencial reclivagem de Cas9n.</li>
	<li>Construa o vetor de direcionamento final seguindo um protocolo estabelecido10. NOTA: No vetor de segmentação usado aqui, um de seleção puro-deltaTK acionado por promotor PGK é flanqueado por repetições invertidas de transposon.</li>
</ol>3. Edição genética de células-tronco pluripotentes humanas
<ol><li>Manter células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2 em superfícies recombinantes revestidas com laminina 521 (5 μg/mL) em meio mTeSR113. As células devem atingir 70-85% de confluência após 72 horas após uma proporção de divisão de 1:3. NOTA: Se presente, remova as células espontaneamente diferenciadas antes da mudança diária do meio, aspirando-as suavemente.</li>
	<li>No dia da transfecção, revestir poços suficientes de uma placa de 24 poços com 300 μL da solução de laminina 521 (5 μg/mL) a 37 °C por pelo menos 2 h.</li>
	<li>Remova a solução de revestimento suavemente e adicione 300 μL de meio mTeSR1 fresco suplementado com inibidor de 10 μM ROCK a cada poço e, em seguida, coloque a placa de volta na incubadora para receber as células. NOTA: Não permita que as placas sequem em nenhum momento quando a solução de revestimento de laminina for removida.</li>
	<li>Mova as hPSCs de estoque da incubadora, remova o meio gasto e, em seguida, lave as células uma vez usando 1 mL de DPBS estéril 1x.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de reagente de dissociação celular suave a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a 37 °C por 6-8 min para dissociar as células. NOTA: Bata suavemente na placa e verifique se as células podem se desprender facilmente para decidir se a digestão é longa o suficiente.</li>
	<li>Pipete suavemente para cima e para baixo usando uma ponta P1000 para levantar todas as hPSCs.</li>
	<li>Terminar a dissociação adicionando 2 mL de meio mTeSR1 fresco suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM (Y-27632) à suspensão celular.</li>
	<li>Misture bem e transfira a suspensão de célula única para um tubo de 50 mL e centrifugar a 200 x g por 3 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o sobrenadante e ressuspenda bem as células em meio mTeSR1 fresco de 2 mL suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM.</li>
	<li>Conte as células viáveis usando um hemocitômetro. Use Trypan Blue para manchar e excluir células mortas.</li>
	<li>Transfira 8 x 10 5 a 1 x 106 células vivas para um tubo de1,5 mL para cada reação de nucleofeção e centrifugar a 200 x g por 3 min. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante.</li>
	<li>Misture 3 μg dos plasmídeos de expressão Cas9n-sgRNA emparelhados e 5 μg de plasmídeo vetorial alvo em 100 μL de solução/suplemento de nucleofeção mista do kit de nucleofeção de células-tronco humanas. Use o plasmídeo de controle GFP do kit e prepare uma mistura de plasmídeos de controle GFP também. NOTA: É importante fazer uma preparação máxima de todos os plasmídeos para reduzir a contaminação por endotoxinas antes da nucleofecção. A concentração dos plasmídeos deve ser de aproximadamente 1 μg/μL.</li>
	<li>Use a mistura de DNA (volume ~111 μL) para ressuspender as células preparadas e transferi-las para uma cubeta de eletroporação (fornecida com o kit de nucleofeção), evitando bolhas.</li>
	<li>Eletroporate as células usando o dispositivo de nucleofeção, selecionando as condições otimizadas para células-tronco pluripotentes humanas. NOTA: Se estiver usando o kit de nucleofeção para células-tronco pluripotentes humanas pela primeira vez, é necessário testar o programa de eletroporação e escolher o mais eficiente.</li>
	<li>Adicionar imediatamente 500 μL de meio fresco e quente a 37 °C mTeSR1 suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM às células eletroporosas. Transferir a mistura para 2 poços de uma placa de 24 poços preparada a partir das etapas 3.2 e 3.3.</li>
	<li>Coloque rapidamente a placa de volta à incubadora de 37 °C/5% de CO2 e permita que as células se recuperem.</li>
	<li>12-16 h depois, mude o meio de manutenção celular. Se as células estabeleceram contato célula-célula, retire o inibidor de ROCK, se não, continue suplementando o meio com o inibidor.</li>
	<li>Entre 24-48 h, verifique a eficiência da nucleofeção examinando a expressão de GFP nas células de controle. As células GFP positivas devem ser de pelo menos 30%.</li>
	<li>48 h após a nucleofecção, comece a selecionar as células suplementando o meio mTeSR1 com 1 μg/mL de puromicina.</li>
	<li>72 h após a nucleofecção, complementar o meio mTeSR1 com 0,5 μg/mL de puromicina. Se a confluência celular for inferior a 30%, complemente também o meio com inibidor de ROCK de 10 μM.</li>
	<li>4-6 dias após a nucleofecção, passagem das células resistentes à puromicina para placas de 10-15 x 96 poços na concentração de 0,8 células / poço. NOTA: É essencial complementar o meio com inibidor de ROCK de 10 μM e puromicina de 0,5 μg/mL.</li>
	<li>Manter essas células a 37 °C/10% de CO2 durante 10-12 dias para formar colónias de células únicas. Recarga média uma vez 7 dias após a semeadura. NOTA: O aumento do nível de CO2 ajuda as hPSCs individuais a formar colônias a partir de nossa experiência.</li>
	<li>Marque os poços contendo uma única colônia e substitua o meio por um meio mTeSR1 fresco contendo 0,5 μg/mL de puromicina, mas sem inibidor de ROCK. NOTA: A partir deste ponto, as células serão cultivadas sob 37 °C/5% de CO2.</li>
	<li>Dois dias depois, troque de meio para poços contendo colônias indiferenciadas. Complemente o meio com inibidor de ROCK de 10 μM e puromicina de 0,5 μg/mL. NOTA: Em alguns poços, as células podem ter se diferenciado e precisam ser descartadas.</li>
	<li>Use pontas de pipeta P2 para raspar as colônias suavemente. Transfira a suspensão celular derivada de uma colônia para 2 novos poços em placas separadas de 96 poços e use um para genotipagem e um para manutenção. NOTA: É importante manter cuidadosamente as colônias e manter o nível de diferenciação espontânea ao mínimo.</li>
	<li>Retirar a placa que contém células para genotipagem quando a confluência na maioria dos poços atingir 50% ou mais. Despeje o meio gasto e, em seguida, lave as células uma vez com DPBS.</li>
	<li>Lise bem as células usando tampão de lise de Bradley e isole o DNA genômico de cada poço na placa seguindo o protocolo associado (https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate).</li>
	<li>Utilizar um método de PCR de junção de três primers para genótipo os braços de homologia esquerdo e direito de forma independente10. NOTA: Um esquema mostrando o método de PCR é apresentado na Figura 2.</li>
	<li>Envie os produtos de PCR de junção para ambos os braços de homologia de 4-5 colônias para sequenciamento de Sanger e obtenha as sequências. NOTA: O resultado do sequenciamento de 2 colônias estabelecidas é mostrado na Figura 3A.</li>
	<li>Mantenha as colônias com o genótipo correto e descarte o resto.</li>
	<li>Expanda as colônias corretas sob seleção contínua de puromicina e congele-as o mais cedo possível.</li>
</ol>4. Remoção do transposon das células-tronco pluripotentes humanas visadas
<ol><li>Manter uma colônia com genótipo correto sob seleção de puromicina de 0,5 μg/mL.</li>
	<li>Nucleofect 8 x 10 5 a 1 x 106 células com5 μg de transposase hiperativa (pCMV-hiPBase) conforme descrito acima (Secção 3, passos 3.4-3.18). Realize uma nucleofeção de controle de GFP em paralelo. NOTA: A puromicina deve ser removida do meio mTeSR1 imediatamente após a nucleofecção destas células.</li>
	<li>Crescer e rastrear células com o de seleção puro-deltaTK removido seguindo os procedimentos publicados10. NOTA: É importante seguir os procedimentos originais cuidadosamente. FIAU, ou 1-(2-desoxi-2-fluoro-β-d-arabinofuranosil)-5-iodouracil), foi usado como um análogo da timidina para a seleção negativa baseada em timidina quinase derivada do vírus Herpes simplex (HSV-tk).</li>
	<li>Sequencie a região modificada para confirmar a remoção do transposon. NOTA: O resultado do sequenciamento de 3 colônias estabelecidas é mostrado na Figura 3B.</li>
	<li>Mantenha as colônias com o genótipo correto e expanda para uso posterior.</li>
	<li>Realizar caracterização dos marcadores de pluripotência nas colônias escolhidas antes de utilizá-los para posterior análise. NOTA: A caracterização de duas colônias estabelecidas é mostrada na Figura 4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.H é co-fundador, acionista e diretor da Stemnovate Limited.

O protocolo aqui descrito pode ser usado para introduzir mutações pontuais predeterminadas em um locus endógeno em hPSCs. A combinação de um vetor alvo à base de piggyBac e plasmídeos de expressão CRISPR/Cas9n pareados mostrou-se confiável e eficiente11. Após a edição do gene HNF4α, 12 dos 43 clones analisados foram corretamente direcionados, conforme determinado pela triagem de PCR de junção. Especificamente, a eficiência de direcionamento bialélico foi de cerca de 21% (9/43) e a eficiência de direcionamento monoalélico foi de cerca de 7% (3/43).
Após os experimentos de segmentação, é crucial manter a seleção de puromicina para manter o locus alvo acessível à transposase piggyBac durante a primeira rodada de triagem. Isso minimizará o silenciamento do de seleção puro-deltaTK acionado pelo promotor PGK e reduzirá o fundo na segunda rodada de triagem10. Um relatório recente mostrou que o promotor CAG é mais resistente ao silenciamento do que o promotor PGK em hPSCs14. Mudar o promotor para o de seleção poderia, portanto, melhorar este sistema no futuro. Também é importante comparar o número de colônias resistentes de células transfectadas com HIPBase e GFP. Após a remoção bem-sucedida do transposon, deve haver mais colônias sobreviventes das células transfectadas com HIPBase do que GFP. Além da análise por PCR da excisão do transposon, o sequenciamento direto da região modificada é necessário para confirmar a fidelidade da excisão.
Com base na estratégia de vetores de segmentação baseada em transposon piggyBac da Yusa 9,10, os procedimentos detalhados acima se concentraram em melhorar a nucleofeção de hPSCs e a eficiência da clonagem de células únicas. A densidade de semeadura celular foi otimizada para reduzir a probabilidade de formação de colônias heterogêneas. Também empregamos cultura de 10 a 12 dias sob 10% de CO2 para aumentar a produção de colônias para triagem de genótipos. Em nossa experiência, cerca de 20 colônias puderam ser obtidas de cada placa de 96 poços. Embora essa etapa possa levar mais tempo do que outros métodos, ela é confiável e altamente eficiente.
Com base na necessidade, os vetores de segmentação podem ser projetados para introduzir ou corrigir mutações pontuais, para criar linhagens celulares repórteres, bem como a expressão gênica knockout. Em conclusão, a combinação do sistema CRISPR/Cas9(n) e um vetor alvo é uma maneira eficiente de fornecer diferentes tipos de hPSCs geneticamente modificadas.

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) representam uma fonte ilimitada de células somáticas para a pesquisa ou para a clínica1. A segmentação de genes em hPSCs oferece um método poderoso para estudar a função gênica durante a especificação celular e entender os mecanismos da doença. Embora existam métodos eficientes de edição de genoma, modificar genes em hPSCs permanece tecnicamente desafiador. O direcionamento padrão de genes por recombinação homóloga em hPSCs ocorre em baixa frequência ou é mesmo indetectável em alguns genes 2, e o direcionamento de genes estimulado por quebra de fita dupla de DNA (DSB) (denominado edição de genes) é, portanto, necessário nessas células 2,3. Além disso, a transfecção de hPSCs e a subsequente clonagem unicelular não são muito eficientes, embora a apoptose associada a uma única célula possa ser reduzida com o uso do inibidor da proteína quinase associada ao Rho (ROCK)4. Finalmente, as potenciais mutações no alvo e fora do alvo no gene de interesse também podem ser problemáticas. Portanto, um protocolo confiável é essencial para fazer alterações genéticas personalizadas em hPSCs.
A tecnologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) guiada por RNA e a proteína 9 (Cas9) associada à CRISPR são agora uma ferramenta bem estabelecida na edição de genes. O RNA CRISPR transcrito (crRNA) e um RNA transativador (tracrRNA) formam o RNA guia único (sgRNA), que se complexa com a proteína Cas9 permitindo a clivagem específica do gene5. O sistema CRISPR/Cas9 é programável, alterando uma sequência de guia de 20 pb do sgRNA, o que significa que quase qualquer locus que atenda ao requisito de motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) pode ser editado. No entanto, o tipo selvagem Cas9 pode tolerar algumas incompatibilidades entre sua sequência de guia e um alvo de DNA, o que pode causar efeitos indesejados fora do alvo. Para melhorar sua especificidade, um mutante nickase (Cas9n) foi desenvolvido. Um Cas9n contendo mutação D10A ou N863A possui apenas um domínio nuclease funcional e, como resultado, só pode cortar o DNA em uma fita. Um par de Cas9n adequadamente espaçado e orientado pode efetivamente induzir DNA DSB e os efeitos fora do alvo são drasticamente reduzidos6. Para garantir uma modificação eficiente do Cas9n, foi demonstrado que dois sgRNA Cas9n devem ser idealmente colocados com um deslocamento de -4 a 20 pb e sempre criar uma saliência de 5'6.
O DSB induzido por Cas9(n)-sgRNA pode ser utilizado para edição de genoma em hPSCs 7,8. Pode criar nocaute de genes através de reparo de junção final não homóloga, ou introduzir modificação genética através de reparo dirigido por homologia (HDR) se um molde de DNA do doador estiver presente. O protocolo aqui descrito utiliza um plasmídeo doador baseado em transposon piggyBac (ou vetor alvo) para HDR, no qual um marcador de resistência a medicamentos é flanqueado pelas repetições invertidas de transposon. A vantagem dessa abordagem inclui triagem eficiente e edição de genes sem costura, como demonstrado primeiramente por Yusa et al.9,10. O de seleção de fármacos permite o enriquecimento de células com o vetor integrado, que são posteriormente rastreadas por PCR de junção para identificar aquelas derivadas por HDR. Além disso, o de seleção de drogas pode ser posicionado para substituir as sequências-alvo para a clivagem Cas9(n), de modo que nenhuma outra quebra de DNA ocorra após o HDR, eliminando assim as mutações "on" do alvo resultantes da reclivagem Cas9(n). Além disso, ao explorar a excisão precisa catalisada pela transposase piggyBac, o marcador de seleção é então extirpado do genoma sem deixar uma cicatriz. Apenas a sequência endógena original de ATT para inserção de piggyBac permanece após a remoção do marcador de seleção de drogas9. Mesmo que os sítios TTAA tenham de ser criados através da introdução de substituições, as hipóteses de perturbação dos elementos regulamentares são reduzidas em comparação com outros métodos10.
Aqui descrevemos procedimentos detalhados para implementar a edição contínua do genoma em hPSCs. Combinando um plasmídeo doador à base de piggyBac e o mutante CRISPR-Cas9 nickase em uma seleção genética de duas etapas, introduzimos duas mutações pontuais predeterminadas no gene11 do fator nuclear de hepatócitos 4 alfa (HNF4α). Essa abordagem é confiável e eficiente, e tem permitido análises aprofundadas dos importantes papéis desempenhados pelo HNF4α na especificação de endodermes e hepatócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human SSEA4 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-8843-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0159-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS with calcium and magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIAU</td>
			<td>Moravek</td>
			<td>M251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle cell dissociation reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 human embryonic stem cells</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human OCT4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB19857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPH-5012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG3 isotype control PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4742-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV-hyPBase</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td>
			<td>Wellcome Trust Sanger Institute</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>PX462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin maxiprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant laminin 521</td>
			<td>BioLamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632(Dihydrochloride)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCM075</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

Endonucleases personalizadas, como as Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Interespaçadas Agrupadas (CRISPR)-Cas9 guiadas por RNA, permitem a edição eficiente do genoma em células de mamíferos. Aqui descrevemos procedimentos detalhados para editar perfeitamente o genoma do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) como um exemplo em células-tronco pluripotentes humanas. Combinando um plasmídeo doador à base de piggyBac e o mutante CRISPR-Cas9 nickase em uma seleção genética de duas etapas, demonstramos o direcionamento correto e eficiente do locus HNF4α.

Segmentação da estratégia de knock-in baseada em vetores O gene do fator nuclear de hepatócitos 4 alfa (HNF4α) foi escolhido para a edição do genoma direcionado para introduzir duas mutações pontuais no éxon 8. Um par de Cas9n-sgRNA com deslocamento de 11 pb foi projetado perto do local a ser modificado. O vetor de direcionamento baseado em piggyBac funcionou como o modelo de reparo direcionado por homologia para introduzir as mutações pontuais desejadas. Um 967 bp 5'-HA e um 1142 bp 3'-HA incorporando substituições nucleotídicas sinônimas ou as mutações pontuais desejadas foram amplificados e clonados no vetor alvo final. O local de inserção do piggyBac estava a 16 pb e a 22 pb das duas mutações pontuais desejadas. Colônias contendo o de seleção puro-deltaTK foram selecionadas com puromicina na primeira rodada. Uma vez que o de seleção foi removido por excisão da transposase na segunda rodada, o local alvo foi modificado perfeitamente com apenas as mutações pontuais desejadas incorporadas no gene (Figura 1).
Edição genética em células-tronco pluripotentes humanas Para a triagem de células corretamente direcionadas, foi utilizado um método de três PCR baseado em primer para genotipagem (Figura 2). O sequenciamento de Sanger foi realizado para confirmar os resultados da PCR (Figura 3A). Após a retirada do de seleção, a região modificada foi sequenciada novamente para confirmar a correta introdução das mutações pontuais desejadas (Figura 3B).
Estabelecimento de colônias e caracterização de células-tronco pluripotentes humanas editadas Colônias com o genótipo correto foram selecionadas e expandidas conforme necessário. As colônias estabelecidas precisam ser caracterizadas antes de serem usadas para análises posteriores. As células editadas possuem a mesma morfologia que as células parentais (Figura 4A). Eles também expressam marcadores representativos de células-tronco pluripotentes humanas, incluindo fatores de transcrição NANOG e OCT4 (Figura 4 B), bem como marcadores de superfície celular SSEA4 e TRA-1-60 (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> Figura 1: Visando a estratégia de knock-in baseada em vetores11. Um par de plasmídeos de expressão de Cas9n-sgRNA foi usado para induzir a quebra de fita dupla de DNA no éxon 8 do gene HNF4α. Um vetor alvo com de seleção foi usado para introduzir mutações pontuais predeterminadas localizadas a 16 pb e 22 pb de distância. Este de seleção estava contido no transposon piggyBac , consistindo de um marcador de seleção positivo-negativo (puro-deltaTK) acionado por um promotor constitutivamente ativo (PGK). Através da via de reparo dirigida por homologia, as células-alvo incorporaram o de seleção. A excisão de transposon mediada pela transposase resulta em uma modificação contínua com apenas as mutações pontuais presentes. Cruz vermelha indica a localização das mutações pontuais desejadas. AH = braço de homologia; PB = piggyBac; PM = mutação pontual. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> Figura 2: Método de PCR baseado em três primers. Para rastrear células-alvo de genes, a genotipagem baseada em PCR foi usada. Três primers, LA-F1, -R1 e -R2 foram utilizados para amplificar a região do braço de homologia esquerda. Independentemente, RA-F1, -F2 e -R1 foram utilizados para amplificar a região do braço de homologia direita. Com base no resultado da eletroforese em gel, as células não direcionadas e as células heterozigotas e homozigotas foram distinguidas umas das outras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> Figura 3: Resultados do sequenciamento de células geneticamente modificadas11. Os produtos de PCR de dois clones foram sequenciados e confirmada a inserção correta do de seleção no locus alvo (A). As repetições terminais invertidas piggyBac (ITR) de 5' e 3' foram ladeadas pelas repetições diretas TTAA. Três clones foram sequenciados após a excisão do transposon (B). Um par de Cas9n-sgRNA com deslocamento de 11 pb foi usado para introduzir a quebra de fita dupla de DNA. Duas mutações pontuais predeterminadas (A a G e A a C) foram introduzidas no gene. Uma mutação sinônima foi introduzida para mutar o motivo protoespaçador-adjacente (PAM), e outra para criar o sítio TTAA necessário para a excisão do piggyBac . <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> Figura 4: Caracterização de células-tronco pluripotentes humanas editadas. Morfologia de duas linhagens celulares editadas e das células parentais (A), barra de escala = 100 μm. A expressão dos marcadores pluripotentes de células-tronco NANOG e OCT4 examinados por imunocoloração (B, barra de escala = 50 μm), além de SSEA4 e TRA-1-60 por citometria de fluxo (C) em duas linhagens celulares modificadas e nas células parentais. A IgG foi utilizada como controle negativo. DAPI foi usado para corar o núcleo. As porcentagens foram calculadas como a média de três experimentos independentes. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

3.9K visualizações.  University of Edinburgh. Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

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Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Mapeando as Interações RNA-ARN Globalmente Usando Psoraleno Biotinilado

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Genética

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing in C. albicans requires Cas9, guide RNA, and repair template. A plasmid expressing a yeast codon optimized Cas9 (CaCas9) has been generated. Guide sequences directly upstream from a PAM site (NGG) are cloned into the Cas9 expression vector. A repair template is then made by primer extension in vitro. Cotransformation of the repair template and vector into C. albicans leads to genome editing. Depending on the repair template used, the investigator can introduce nucleotide changes, insertions, or deletions. As C. albicans is a diploid, mutations are made in both alleles of a gene, provided that the A and B alleles do not harbor SNPs that interfere with guide targeting or repair template incorporation. Multimember gene families can be edited in parallel if suitable conserved sequences exist in all family members. The C. albicans CRISPR system described is flanked by FRT sites and encodes flippase. Upon induction of flippase, the antibiotic marker (CaCas9) and guide RNA are removed from the genome. This allows the investigator to perform subsequent edits to the genome. C. albicans CRISPR is a powerful fungal genetic engineering tool, and minor alterations to the described protocols permit the modification of other fungal species including C. glabrata, N. castellii, and S. cerevisiae.

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

Efficient genome engineering of Candida albicans is critical to understanding the pathogenesis and development of therapeutics. Here, we described a protocol to quickly and accurately edit the C. albicans genome using CRISPR. The protocol allows investigators to introduce a wide variety of genetic modifications including point mutations, insertions, and deletions.

Mediada por CRISPR genoma edição do patógeno humano fungo Candida albicans

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...