يسمح هذا البروتوكول بدراسة بدء وتطوير الاستجابات العصبية في الجهاز العصبي المحيطي في الجهاز العصبي المحيطي للماوس أثناء العدوى الفيروسية. مع هذا النموذج، تنتقل العدوى مسافة أكبر من المحيط إلى الجهاز العصبي المحيطي والمركزي، مما يسمح بإجراء تقييم أقصى لحركيات الاستجابة العصبية. بعد وضع خمسة إلى سبعة أسابيع من العمر تخدير C57BL/6 الماوس في موقف supine على وسادة جراحية, تأكيد عدم وجود استجابة لدواسة منعكس.
واستخدام 100 إلى 180 حصى emery المجلس، لbrade بلطف الجلد جلاروس من لوحة القدم الخلفية واحدة بين كعب ومنصات المشي مع حوالي 20 يمر من المجلس. ثم استخدام ملقط غرامة لتقشير ببطء قبالة طبقة القرنية فصلها من قبل الكشط لفضح الطبقة basale. بعد خلط لطيف، تطبيق موضعيا 20 ميكرولترات من تتر المناسبة من الفيروس inoculum على لوحة القدم abraded.
تنفيذ التطعيمات وهمية مع المتوسطة فقط في لوحات المشاة المتآكلة من الحيوانات السيطرة في موازاة. بعد كل تطبيق، فرك بلطف على footpad 10 مرات مع رمح إبرة لتسهيل الامتزاز من الفيروس كل 10 دقيقة لمدة 30 دقيقة. عندما يتم تجفيف لوحة القدم المشطمة ، اسمح للفئران بالتعافي مع المراقبة حتى إعادة شغل المؤخرة قبل وضع الحيوانات في أقفاص فردية للمتابعة السريرية وأخذ العينات.
في الوقت التجريبي المناسب، وجمع الجهازين الفيروس يتعرض، بما في ذلك القلب والرئتين والطحال والبنكرياس والكبد والكلى والمثانة في 1.5 ملليلتر الفردية microtube على الجليد. ثم حصاد منصات المشاة المتآكلة بين الكعب ومنصات المشي ووضع العينات في الأنابيب الدقيقة الفردية 1.5 ملليلتر على الجليد. المقبل، وضع الماوس في موقف عرضة والرطب الفراء مع 70٪ الإيثانول.
لفضح العمود الفقري، قم بعمل شق صغير في منطقة الحوض وتجريد الجلد من الأطراف الخلفية نحو الرأس. لإزالة الـ 55555، استخدم المقص لقطع متوازي مع العمود الفقري على كلا الجانبين وعلى مقربة منه. وأزيل الرأس عند قاعدة الجمجمة
استخدام مقص لفتح الجمجمة من ماغنوم ماغنوم foralmen إلى العظام الأمامية. واستخدم ملقط لسحب فتح الجمجمة في اتجاه الجانبي. ثم استخدام ملقط لغرف بلطف خارج الدماغ ووضع الدماغ في 1.5 ملليلتر microtube على الجليد.
استخدم المقص المنحني لتنظيف العمود الفقري من العضلات والدهون والأنسجة الرخوة، وإزالة الذيل. ثم ضع العمود الفقري السليم في أنبوب 15 ملليلتر من PBS الجليد البارد العقيم على الجليد لمدة لا تزيد عن ثلاث ساعات. بعد تشريح, نقل الحبل الشوكي في طبق ثقافة الأنسجة للسماح بإزالة أي الأنسجة الرخوة المتبقية.
استخدم شفرة حلاقة لإجراء ثلاث قطع عرضية عبر العمود الفقري في S2 و L1 وفقرات T1. نقل القطع إلى أطباق فردية 15 ملليمتر تحتوي على الثلج الباردة العقيمة PBS. تتبع وتحديد أصول الشرائح لتحليلها لاحقاً.
بعد ذلك ، استخدم ملقط لتأمين جانب آخر من شرائح الظهر واستخدام شفرة حلاقة لجعل قطع واحد طولي من خلال خط الوسط لتقسيم العمود إلى نصفين متساويين. ضع كلا النصفين في طبق بيتري جديد يحتوي على برنامج تلفزيوني بارد ثلجي جديد وعقيم في الاتجاه الأصلي ليتمكن من التمييز بين الجانبين الأيسر والأيني من العمود الفقري. تحت مجهر تشريح، واستخدام ملقط غرامة لقشر بلطف الحبل الشوكي من كل نصف العمود الفقري في اتجاه روسترالي إلى السد.
ثم ضع كل من أنصاف الحبل الشوكي في الأنابيب الدقيقة الفردية 1.5 ملليلتر التي تحتوي على 500 ميكرولترات من PBS الجليد البارد العقيم على الجليد. لفضح ganglion الجذر الظهري، وإزالة بلطف السحايا من جانب واحد من العمود الفقري إلى الآخر. واسحب العصب الشوكي الأبيض المكشوف من العمود الفقري
حصاد جولة، شفافة العقدة الجذر الظهري من الجزء العمود الفقري في طبق بيتري 15 ملليمتر من الجليد البارد PBS. وجمع العقدة جذر الظهرية ipsilateral و contralateral كما أظهرت للتو. بعد حصاد العصب الشوكي و العقدة جذر الظهر من أجزاء العمود الفقري الأخرى اثنين كما أظهرت للتو، الطرد المركزي جميع أنابيب الأنسجة بسرعة عالية.
ثم التعرق على السبيع وفلاش تجميد العينات في النيتروجين السائل، وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى التجانس. بالنسبة لتجانس الأنسجة، اذيب أنابيب الأنسجة المجمدة على الجليد قبل أن تزن 100 ملليغرام من كل عينة. نقل إلى أنبوب microcentuge ملليلتر تحتوي على حبات معقم و 500 ميكرولترات من العازلة فحص المناعة الشعاعية.
بعد ذلك، تعطل الأنسجة في درجة حرارة الغرفة على التجانس في 20 دورة في الثانية لمدة دقيقتين، تليها فترة انتظار دقيقة واحدة، و 20 دورة في الثانية لمدة دقيقتين إضافيتين. بعد الجولة الثانية من التجانس، الطرد المركزي الأنسجة بسرعة عالية قبل نقل 500 ميكرولترات من كل عظمى إلى أنبوب جديد المسمى بشكل مناسب. تخزين في ناقص 20 درجة مئوية حتى تحليل المصب.
موقع التآكل مرئي في لوحة التحكم. وهو نموذجي للقشرة لتشكيل في موقع الكشط كجزء من عملية الشفاء. في المقابل ، تظهر الفئران المحمضة بـ pseudorabies التهابًا حادًا في لوحة القدم عند نقطة النهاية الإنسانية التي تتميز بالتورم والاحمرار.
يكشف الفحص الهدى للوحة القدم الملقح والجذر الظهري نخر البشرة والتهاب الجلد الحاد داخل أقسام القدم المصابة في pseudorabies. كما لوحظ تسلل العدلات في أقسام الحمض الوباءاتية المصابة. يتم قياس زيادة كبيرة في تعبير بروتين G-CSF في عقدة القدم والجذر الظهري للفئران المصابة بالرشاشات الزائفة مقارنة بالضوابط في كل من سبع ساعات و82 ساعة بعد العدوى.
كما لوحظت مستويات كبيرة من الـ G-CSF في 82 ساعة بعد العدوى في الحبل الشوكي والدماغ والقلب وأنسجة الكبد من الفئران المصابة بـ pseudorabies مقارنة بالتحكم. وعلاوة على ذلك، يتم الكشف عن مستويات كبيرة من IL-6 في جميع الأنسجة المختبرة من الفئران المصابة بـ pseudorabies بدءا من 24 ساعة بعد العدوى. في حالة احتضار، تم الكشف عن pseudorabies في لوحة القدم، ganglion الجذر الظهري، الحبل الشوكي، والدماغ.
مع التعبير السيتوبلازمي عالية من psuedorabies جليكوبروتين gB في الخلايا العصبية من العقدة جذر الظهر في الفئران المصابة pseudorabies. لضمان نجاح العدوى، من المهم ألا تسقط قطرة الفيروس في العمود من لوحة القدم المشطَطة. قد يخدم هذا النموذج الحيواني منصة لاختبار فعالية الأدوية المضادة للالتهابات ومضادات الفيروسات من أجل منع الاعتلال العصبي المحيطي الناجم عن الفيروسات.
