A pesquisa descrita neste artigo foi realizada na instalação do BMIT na Canadian Light Source, que é apoiada pela Fundação canadense para Inovação, Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá, universidade de Saskatchewan, governo de Saskatchewan, Diversificação Econômica Ocidental do Canadá, Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá e Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde. Os autores gostariam de agradecer aos cientistas de linha de luz canadenses na Canadian Light Source, particularmente Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov e Ning Zu pela assistência na configuração e solução de problemas dos sistemas de microscópio SkyScan SRμCT e feixe branco. Também queremos agradecer a Beth Dalzell, da Faculdade de Medicina e Ciências da Vida da Universidade de Toledo, e ao Dr. Jeffrey Wenstrup, da Universidade Médica do Nordeste de Ohio, pelo acesso a amostras cadavéricas para este estudo. JM Andronowski é apoiado por meio de fundos de pesquisa de start-up fornecidos pela Universidade de Akron e uma bolsa do Instituto Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Justiça em Ciência Forense para Fins de Justiça Criminal (2018-DU-BX-0188). RA Davis é apoiado por uma assistente de pós-graduação fornecida pela Universidade de Akron. Equipamentos e suprimentos utilizados para coring e serragem foram comprados por fundos de start-up fornecidos pela Universidade de Akron e NSF concedem EAR-1624242 à CW Holyoke.

Todos os espécimes foram provenientes de doadores cadavéricos embalsamados na Universidade de Toledo, Faculdade de Medicina e Ciências da Vida e na Universidade Médica do Nordeste de Ohio (NEOMED), com o consentimento informado do próprio doador ou dos parentes mais próximos do doador. O Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Akron para a Proteção dos Sujeitos Humanos (IRB) considerou esses espécimes isentos de revisão completa do IRB, pois não foram adquiridos de indivíduos vivos. Informações demográficas, incluindo idade, sexo e causa da morte estavam disponíveis para todos os doadores. Os indivíduos selecionados não apresentaram condições de afetação óssea documentadas nem exposição a regimes de tratamento que possam ter afetado a remodelação óssea no momento da morte. Amostras ósseas corticais foram obtidas a partir de femora de machos e fêmeas cadavéricos modernos com idades entre 19 e 101 anos de idade (média = 73,9 anos). O meio-eixo femoral tem sido estudado extensivamente incluindo exames de variação na porosidade cortical20,21,22,23,24 e densidade material do tecido ósseo25,26,27, e tornou-se, assim, um local comumente utilizado para análises microestruturais.
1. Aquisição de tecidos e Maceração
<ol><li>Use uma serra oscilante equipada com uma lâmina de carboneto de corte de mergulho (para materiais compostos) para obter ~7,5 cm blocos ósseos das diafísicas médias da femora esquerda.</li>
	<li>Mergulhe os blocos femorais em um prato de vidro seguro para forno recheado com uma enzima de protease em pó e solução de água da torneira por 1 h em uma incubadora a 45 °C.</li>
	<li>Após a incubação, remova cuidadosamente quaisquer tecidos moles e periósteos restantes usando dissecção sem cortes ou ferramentas dentárias. NOTA: Evite o uso de ferramentas afiadas (por exemplo, bisturi) para remover tecidos moles. Tais instrumentos podem causar danos ao osso detectável em escaneamentos μCT, afetando a preservação da amostra e a qualidade dos dados de varredura.</li>
	<li>Remova detritos ou oclusãos na cavidade medular colocando blocos ósseos em um limpador ultrassônico por 5-10 minutos com 20:1 partes de água da torneira para solução de limpeza (ver Tabela de Materiais) ou usando um fio dental de água portátil (por exemplo, Waterpik).</li>
	<li>Mergulhe o bloco ósseo em um copo de espécime e encha com 70% de etanol. Deixe o osso de molho por pelo menos 24 horas para remover lipídios. NOTA: Os xilenos também podem ser usados para remover lipídios. A imersão prolongada em xileno, no entanto, pode tornar o osso frágil ou calcário, pois é um emulsificante.</li>
	<li>Após 24 horas, remova os blocos ósseos do etanol e deixe secar ao ar à temperatura ambiente por 24-48 horas. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>2. Secção tecidual
<ol><li>Coloque um deslizamento de microscópio de vidro de 75 x 25 mm em uma placa quente definida para 140 °C. Derreta uma quantidade generosa de resina térmica epóxi (ver Tabela de Materiais) no centro do slide.<ol>
<li>Se preparar seções finas adicionais para microscopia (<50 μm), o bloco ósseo pode precisar ser incorporado em uma epóxi de duas partes para preservar a trabecula. Além disso, ao implementar este protocolo para espécimes frágeis (por exemplo, osso diagenético ou espécimes altamente trabecularizados) é necessário incorporar espécimes em um epóxi. NOTA: As amostras ósseas utilizadas neste protocolo foram recuperadas de amostras cadavéricas embalsamadas. Se amostras novas forem coletadas na autópsia ou em um caso cirúrgico para examinar estruturas de tecidos moles (por exemplo, vasculatura) via SRμCT, a impregnação com epóxi pode induzir danos a tais tecidos. Nestes casos, recomenda-se um meio adesivo alternativo ou de montagem (por exemplo, fita dupla face, argila de modelagem).</li>
	</ol></li>
	<li>Pressione o aspecto inferior do bloco ósseo na resina epóxi térmica na lâmina do microscópio, com o comprimento do osso perpendicular ao slide. Deslocar a amostra para frente e para trás, a fim de revestir a parte inferior do osso e garantir a adesão segura ao slide.</li>
	<li>Deixe o espécime montado descansar sobre a placa quente por ~5 minutos para permitir que o epóxi térmico se mete em poros e/ou rachaduras. NOTA: O epóxi no slide deve estar livre de bolhas para melhor adesão. Para remover bolhas, mude a amostra para frente e para trás no slide. Bolhas geralmente se formam devido à água e/ou etanol preso dentro do osso escapando e evaporando.</li>
	<li>Remova o slide com a amostra montada da placa quente usando fórceps sem cortes e deixe esfriar à temperatura ambiente por ~10 minutos. Remova qualquer epóxi da borda do slide usando uma lâmina de barbear para garantir que o mandril segure adequadamente o slide.</li>
	<li>Conecte o slide com a amostra aderida a um mandril de deslizamento de vidro e monte o mandril no braço giratório de uma serra de seção de velocidade lenta (ver Tabela de Materiais, Figura 2). NOTA: Enquanto uma serra Buehler IsoMet foi empregada neste protocolo, outras serras de seção de precisão estão disponíveis que poderiam ser usadas no lugar do IsoMet (por exemplo, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).</li>
	<li>Ajuste o braço giratório usando o mostrador de posicionamento para garantir os contatos da lâmina e transcecte a amostra. Posicione a amostra de tal forma que uma seção transversal do osso será cortada perpendicular ao seu comprimento.</li>
	<li>Adicione pesos ao outro lado do braço de corte para combater o peso do braço. NOTA: Se for utilizado o contrapeso insuficiente, a amostra pode suportar a lâmina e causar a fratura da lâmina.</li>
	<li>Adicione fluido de corte (20:1 partes de água ao fluido de corte) ao recipiente fluido da serra.</li>
	<li>Segure firmemente a lâmina do wafer de diamante e certifique-se de que o nível do fluido submerge a porção de corte da lâmina. Ajuste a velocidade para 200 RPM e baixe lentamente a amostra na lâmina(Figura 3).</li>
	<li>Certifique-se de que a lâmina e o mandril não estão balançando e/ou saltando. Se for observado movimento excessivo, pare imediatamente a serra e aperte a lâmina e/ou o conjunto do braço de mandril antes de retomar o corte. Adicione contrapesos adicionais se o mandril estiver se movendo agressivamente para cima e para baixo. O movimento excessivo, incluindo o movimento visível lado a lado, pode causar a fratura da lâmina.</li>
	<li>A primeira seção grossa é um "corte de resíduos" para fornecer uma superfície bem definida paralela a cada corte adicional. Após o corte inicial do resíduo, levante o braço giratório e mova o mandril em direção à lâmina 5 mm usando o mostrador de posicionamento. Seções mais grossas (~1 mm) para microscopia podem ser coletadas com este método. NOTA: Para economizar tecidos valiosos, o corte de resíduos pode ser omitido. Ao seccionar uma amostra com uma borda desigual, no entanto, é fundamental que o pico do espécime seja alinhado tangencialmente até a borda da broca de coring.<ol>
<li>Certifique-se de explicar o meio-fio da lâmina ao seção. Por exemplo, para obter uma seção de 5 mm de uma lâmina que tem um kerf de 0,5 mm, mova a amostra e jogue 5,5 mm em direção à lâmina.</li>
	</ol></li>
	<li>Após a secção completa, coloque o deslizamento de vidro com o espécime montado em uma placa quente para derreter o epóxi térmico. Isso permite a remoção rápida de blocos ósseos do slide. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>3. Coring de amostra
<ol><li>Monte seções ósseas de 5 mm até o fundo de uma lata de alumínio rasa (~8 cm de diâmetro) utilizando a técnica de ligação térmica epóxi, conforme descrito nas etapas 2.2-2.4.</li>
	<li>Coloque estanho em uma mesa de máquina XY da prensa de broca de moinho (ver Tabela de Materiais) e grampos de fixação de aperto de mão(Figura 4).</li>
	<li>Insira 2 mm de coring de coring de poço oco de 2 mm de diâmetro interno (ver Tabela de Materiais) ao mandril de broca de moinho. Ajuste o limitador de profundidade para evitar a coring através da lata(Figura 5).</li>
	<li>Alinhe o aspecto anterior central da amostra óssea abaixo da broca, evitando contato próximo com o periosteum, endosteum ou áreas altamente trabecularizadas. NOTA: A seleção automatizada de cortices femorais médias anteriores não é viável, pois a espessura cortical varia entre os indivíduos, especialmente com o aumento da idade.</li>
	<li>Encha a lata com água destilada para cobrir completamente a amostra. Isso evita o acúmulo de calor, queima da amostra e/ou danos na broca durante a perfuração. NOTA: Para avaliar a possibilidade de danos térmicos causados pelo coring, um termômetro infravermelho foi usado para obter leituras de temperatura da água destilada, pois o trecho penetrou pela primeira vez na superfície dos ossos. A temperatura variou 1 °C, de 22,9 a 23,9 °C entre as dez amostras para este teste. Assim, argumentamos que o dano induzido pelo calor é insignificante.</li>
	<li>Para as primeiras instâncias de contato entre o pedaço do núcleo e o osso, aplique pressão suave para usar um anel na superfície superior do osso. Isso evita a deflexão da broca no início do processo de coring e garante a correta colocação da broca.</li>
	<li>Durante o coring, levante a broca dentro e fora da amostra, mantendo a ponta da broca sob a superfície da água. Continue esta técnica a cada poucos segundos para liberar o pó ósseo preso e garantir que os detritos não estejam ocluindo a broca. NOTA: Se o núcleo estiver formando uma forma cônica, é provável que seja devido a 1) permitindo tempo insuficiente para retirar o pó ósseo da broca de coring, e 2) o coring está ocorrendo muito rapidamente. O aumento da velocidade pode quebrar grandes pedaços da amostra e pulverizar o aspecto superior.</li>
	<li>Após a conclusão do coring, o núcleo ósseo resultante pode ficar alojado na broca de haseada oca(Figura 6). Use um par de fórceps finos ou uma pequena chave Allen para desalojar o núcleo da broca(Figura 2).</li>
	<li>Armazene a amostra de cored em um tubo de microcentrifuuge rotulado em um local frio e seco até a imagem.</li>
</ol>4. Rotinas de processamento de imagem para avaliação de parâmetros microarquiteturais ósseos a partir de núcleos ósseos corticais
<ol><li>Reconstrução de imagens μCT<ol>
<li>Baixe e instale a versão mais recente do NRecon em https://www.bruker.com/products/microtomography.html para reconstrução das imagens de projeção SRμCT.</li>
		<li>Selecione o atalho NRecon no Desktop e o GPUReconServer associado aparecerá.</li>
		<li>Abra o conjunto de dados desejado na janela pop-up. Se a janela não aparecer, selecione o ícone da pasta no canto superior esquerdo da janela dataviewer.</li>
		<li>Selecione a primeira projeção da aquisição do SRμCT. Em Saída,remova as seleções para Usar ROI e Escalas ON.</li>
		<li>Escolha o destino do arquivo de reconstrução. Selecione Procurar e criar uma nova pasta chamada Recon. O formato de arquivo selecionado deve ser BMP(8).</li>
		<li>Verificar compensação de desalinhamento. NOTA: Esta estimativa é muitas vezes próxima da correta. A renderização 3D áspera pode ser ajustada manualmente movendo as setas para cima e para baixo para deslocar as imagens sobrepostas para que as bordas direita e esquerda se alinhem o mais próximo possível.</li>
		<li>Em Configurações,escolha seleções desejadas para aplicar suavizar, endurecer o feixe, rotação CS, objeto maior que os algoritmos FOV e Ring Artifacts.</li>
		<li>Ajuste o histograma em Saída selecionando Auto. NOTA: A imagem resultante pode ser fraca.</li>
		<li>Selecione Iniciar o processamento da reconstrução.</li>
		<li>Use nomenclatura padrão para os índices lacunar de canal/osteocito28. Estes podem incluir: volume total de tecido VOI (TV), volume do canal (Ca.V), número total de canais (Ca.N), diâmetro médio do canal (Ca.Dm), porosidade cortical (Ca.V/TV), dado como porcentagem, número total de lacunas (N.Lc) e volume médio de lacunas (Lc.V), entre outros. Para determinar a densidade do lacunar por mm3 (N.Lc/BV), o volume ósseo (VB) é calculado como volume total menos volume do canal (TV-Ca.V). NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de Dados Microarquitecturais a partir de imagens reconstruídas<ol><li>Baixe e instale a versão mais recente do CTAnalyser em https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html para análise de parâmetros microarquiteturais. NOTA: A versão gratuita do CTAnalyser é limitada em funcionalidade. Portanto, recomenda-se a compra de uma licença completa para realizar análises mais detalhadas.</li>
		<li>Sob | de Imagem propriedades | Alterar o tamanho do Pixel,certifique-se de que o tamanho do pixel corresponda ao do protocolo de imagem μCT aplicado. NOTA: Se a edição de imagens no ImageJ ou em um programa semelhante, observe que, ao salvar, o cabeçalho incorporado no arquivo TIFF será modificado e o software de análise alterará o tamanho do pixel ao importar o conjunto de dados.</li>
		<li>Selecione Processamento personalizado a fim de criar uma lista de tarefas (ver Materiais Suplementares), para analisar a microarquitetura óssea a partir do conjunto de dados da varredura. Um protocolo geral para parâmetros de rede de osteocitos usando plugins proprietários do CTAnalyser segue aqui: NOTA: A lista de tarefas do plugin funciona bem para conjuntos de dados onde a amostra é o único assunto visível no FOV. Se o espaço vazio cercar o espécime, a aplicação de um ROI é necessária. Caso contrário, os valores reunidos em Análise 3D e Análise individual de objetos serão artificialmente reduzidos.<ol><li>Recarregue as imagens para redefinir e/ou ajustar quaisquer modificações (por exemplo, de edição no ImageJ ou similar) antes de abrir o menu de Processamento Personalizado no software de análise.</li>
			<li>Para reduzir o ruído nas imagens, aplique um filtro gaussiano de baixa passagem em espaço 3D com um kernel redondo e um raio de 2-3. NOTA: Essas configurações foram aplicadas aos conjuntos de dados dos experimentos SRμCT relatados através de testes de tentativa e erro. O objetivo era obter as melhores reconstruções de qualidade para os dados. Ajuste as configurações de reconstrução para se adequar a cada configuração experimental única.</li>
			<li>Aplique um limiar global de escala de cinza às imagens selecionando valores baixos e altos para destacar canais vasculares. As fatias reconstruídas vistas nas Figuras 8B e 8D retratam um limiar de exemplo de 0-155. NOTA: Semelhante ao passo 4.2.3.2, as configurações de limiar aplicadas aqui foram escolhidas através de tentativa e erro extensos. O limiar deve ser ajustado para cada configuração experimental e sistema de imagem μCT utilizado.</li>
			<li>Despeckle (denoise) para remover manchas brancas em espaço 3D que estão dentro da faixa de tamanho de pixel volutrico (voxel) de osteocito lacunae, a fim de isolar apenas canais. NOTA: Para uma varredura SRμCT de osso cortical humano tomado a 0,9 μm de tamanho de pixel, o limite inferior para lacunas de osteocito é de 13 voxels.</li>
			<li>Despeckle para remover quaisquer manchas pretas no espaço 2D para remover artefatos nos canais. Estes podem ser bastante grandes em 2D, assim remova recursos que são <15.000 pixels.</li>
			<li>Dilatar os poros em espaço 3D usando a função de operação morfológica com um núcleo redondo de 2 ou 3 raios, dependendo da qualidade das imagens, a fim de isolar quaisquer tecidos moles presos nos canais.</li>
			<li>Execute uma função Despeckle adicional usando as mesmas configurações da etapa 4.2.3.5. a fim de remover tecidos moles isolados dentro dos canais.</li>
			<li>Corroer a dilatação do passo 4.2.3.6. usando uma função de operação morfológica usando um kernel redondo com raio de 2 ou 3. O raio desta etapa deve corresponder ao raio utilizado no Procedimento 4.2.3.6.</li>
			<li>Execute a análise 3D e selecione quais parâmetros calcular para o volume de canais vasculares. Geralmente, os valores básicos fornecerão informações suficientes.</li>
			<li>Salve as imagens processadas com Save Bitmaps em uma subpasta personalizada no diretório. NOTA: Se for recomendado criar uma imagem de reconstrução 3D a partir das imagens processadas usando um programa como Amira/Avizo, Dragonfly, Drishti, etc., salvar as imagens como monocromática (1 bit) é recomendado.</li>
			<li>Calcule o número de canais vasculares e descreva seu tamanho, forma e orientação usando a função Análise de Objetos Individuais.</li>
			<li>Repetição passos 4.2.3.1 – 4.2.3.3. para redefinir a imagem para análise de osteocito lacunar.</li>
			<li>Remova as manchas brancas no espaço 3D usando a função Despeckle, garantindo que tais artefatos sejam menores do que o limite inferior do tamanho do lacunar. Esta etapa remove o ruído da varredura que pode parecer ser poros cortical, preservando a verdadeira lacuna de osteociato. Para varreduras humanas de SRμCT de tamanho de pixel de 0,9 μm, este limite inferior é de 13 voxels.</li>
			<li>Despeckle mais uma vez para remover manchas brancas que são maiores do que o limite superior do tamanho do lacunar. Para conjuntos de dados SRμCT humanos com as configurações listadas na etapa 4.2.3.13, este limite é de 2743 voxels.</li>
			<li>Realize análise 3D para extrair informações microestruturais relativas especificamente à lacuna de osteociato.</li>
			<li>Selecione Salvar bitmaps para salvar as imagens processadas, a fim de isolar a lacuna de osteocito.</li>
			<li>Realize a Análise individual de objetos para calcular o número de osteocitos em 3D dentro do Volume de Interesse (VOI) selecionado. NOTA: Uma vez que a lista de tarefas tenha sido estabelecida e testada, a CTAnalyser possui uma função de gerenciador de lotes (BatMan) que pode ser empregada para acelerar a extração de dados e garantir o processamento uniforme de imagem. Uma lista de tarefas com configurações de exemplo para o Procedimento 4.2.3. podem ser encontrados nos Materiais Suplementares.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+of+intracortical+porosity+in+the+midshaft+of+the+human+femur:+age+and+sex+differences.">Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences.</a> Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).</li><li>Jowsey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+Changes+in+Human+Bone.">Age Changes in Human Bone.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).</li><li>Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+skeletal+remodeling+in+aging+men.">Studies of skeletal remodeling in aging men.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).</li><li>Martin, R. B., Burr, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+implications+of+porosity+distribution+in+bone+of+the+appendicular+skeleton.">Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton.</a> Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).</li><li>Bousson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Intracortical+Porosity+in+Human+Midfemoral+Cortex+by+Age+and+Gender.">Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).</li><li>Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+among+microstructural+properties+of+bone+at+the+human+midshaft+femur.">Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur.</a> Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).</li><li>De Micheli, P. O., Witzel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructural+mechanical+study+of+a+transverse+osteon+under+compressive+loading:+The+role+of+fiber+reinforcement+and+explanation+of+some+geometrical+and+mechanical+microscopic+properties.">Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties.</a> Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).</li><li>Martin, R. B., Boardman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+collagen+fiber+orientation,+porosity,+density,+and+mineralization+on+bovine+cortical+bone+bending+properties.">The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties.</a> Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).</li><li>Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgr&#237;msson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+analysis+of+the+canal+network+in+cortical+bone+by+micro-computed+tomography.">Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography.</a> The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).</li><li>Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rib+histomorphometry+for+adult+age+estimation.">Rib histomorphometry for adult age estimation.</a> Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).</li><li>Pfeiffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paleohistology:+Health+and+disease.">Paleohistology: Health and disease.</a> Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).</li><li>Bone Hedges, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=diagenesis:+an+overview+of+processes.">diagenesis: an overview of processes.</a> Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).</li><li>. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: <a target="_blank" href="https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf">https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf</a> (2017)</li><li>Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+formaldehyde+fixation+on+some+mechanical+properties+of+bovine+bone.">Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone.</a> Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).</li><li>Asaka, T., Kikugawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+formaldehyde+solution+on+fracture+characteristics+of+bovine+femoral+compact+bone.">Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone.</a> Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Não houve nenhum protocolo abrangente e padronizado para a aquisição de amostras de núcleo ósseo cortical uniforme e cilíndrico para imagens SRμCT de alta resolução com configurações fov limitadas. O protocolo aqui detalhado preenche esse vazio fornecendo um tutorial abrangente sobre como obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para imagens SRμCT e a visualização e extração precisa subsequente de dados microarquiteturais. Mostramos que nosso protocolo fornece um método mais padro...

Com os recentes avanços na tecnologia de imagem, agora é viável adquirir dados de imagem de raios-X com resolução muito alta. Os sistemas de microcC (μCT) da área de trabalho são o padrão atual para imagens de osso cancelado devido à sua natureza não destrutiva1. Quando as características microestruturais de imagem do osso cortical, no entanto, o uso de μCT tem sido mais limitado. Devido a restrições de resolução, os sistemas de desktop não podem atingir a resolução necessária para a imagem de recursos microestruturais menores que os poros corticais, como a lacuna de osteociato. Para esta aplicação, o SRμCT é ideal devido à maior resolução desses sistemas1. Por exemplo, experimentos na Canadian Light Source (CLS) nas linhas de luz biomédicas de imagem e terapia2 produziram imagens com voxels de até 0,9 μm. Estudos anteriores1,3,4,5 utilizaram esta resolução para adquirir projeções e renderizações tridimensionais subsequentes (3D) de amostras de ossos cortical de ossos longos humanos(Figura 1) para quantificar a densidade do osteocito lacunar4,6,7,8,9 e variação na forma e tamanho3 em toda a vida humana e entre os sexos. Outros estudos demonstraram a presença de banda de osteon em humanos10, fenômeno anteriormente reconhecido como associado apenas a mamíferos não humanos na literatura antropológica forense.
Para alcançar uma resolução excepcional, o feixe de raios-X deve estar bem focado dentro do campo de visão (FOV), que muitas vezes limita o tamanho máximo da amostra a alguns milímetros de diâmetro. Atualmente, não há procedimentos abrangentes e padronizados descritos na literatura delineando a aquisição de amostras ósseas que atendam a essas restrições. O centro de amostras dentro do FOV é fundamental para garantir que 1) a amostra permaneça centrada à medida que gira 180° durante a imagem, e 2) artefatos de varredura sejam limitados, uma vez que não há truncação de imagem. Em outras palavras, nenhuma porção da amostra fora do FOV interfere com o feixe entrando em seu ponto focal dentro do FOV. Se isso ocorrer, o algoritmo de reconstrução é privado de alguns dos dados de atenuação necessários para uma reconstrução totalmente correta. Vale ressaltar ainda que os escaneamentos de 360° (rotação total) minimizam os efeitos do endurecimento do feixe, mas aumentam os artefatos causados pelo desalinhamento e movimento da amostra durante a imagem. Assim, enquanto uma varredura de 360° normalmente gera dados mais limpos, o tempo de imagem é dobrado e, portanto, um compromisso entre custo experimental e qualidade de dados deve ser abordado.
Um aspecto importante e muitas vezes negligenciado dos experimentos de imagem óssea é a técnica precisa e replicável de preparação de amostras realizada antes da varredura. Estudos que incorporam métodos SRμCT em seus experimentos mencionam brevemente seu protocolo amostral, mas os autores fornecem pouco ou nenhum detalhe sobre a metodologia específica usada para coletar seus espécimes. Muitos desses estudos mencionam o corte de blocos ósseos retilícleos de dimensões arbitrárias, mas geralmente não fornecem mais informações sobre as ferramentas ou materiais de incorporação utilizados3,4,10,11,12,13,14. Alguns pesquisadores geralmente usam ferramentas rotativas portáteis (por exemplo, Dremel) para remover blocos retilineares do osso de uma região de interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Este método resulta em amostras de tamanho não uniforme que podem ser maiores que o FOV, aumentando a probabilidade de artefatos de varredura e truncação de imagem. Tais espécimes muitas vezes requerem mais refinação usando uma serra de bola de diamante de precisão (por exemplo, Buehler Isomet). A aquisição de amostras com dimensões consistentes (até os dois centésimos/mm) é fundamental para garantir que os conjuntos de dados adquiridos sejam da mais alta qualidade e os resultados subsequentes sejam replicáveis.
O relatório limitado da metodologia de aquisição de amostras adiciona uma camada extra de dificuldade ao tentar empregar e/ou validar métodos realizados em um estudo anterior. Atualmente, os pesquisadores devem entrar em contato diretamente com os autores para obter mais detalhes sobre seus procedimentos de amostragem. O protocolo aqui detalhado fornece aos pesquisadores biomédicos uma técnica de amostragem completamente documentada, replicável e econômica. O objetivo principal deste artigo é fornecer um tutorial abrangente sobre como obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente usando uma prensa de perfuração de moinho e coring de diamante para a visualização precisa e extração de dados microarquitecturais. Este método é modificado a partir de procedimentos utilizados para coletar rotineiramente cilindros uniformes de pequeno diâmetro (1-5 mm) de blocos de materiais duros em mecânica de rocha de alta pressão15,16,17,18,19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1367px;" width="1367">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">1-1/8&#34; plunge cutting carbide for composites</td>
			<td style="width:120px;">Warrior</td>
			<td style="width:133px;">61812</td>
			<td style="width:899px;">28.6mm plunge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70% Ethanol</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">BP8201500</td>
			<td>3.8 Liters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Blunt-tipped forceps</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">10-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:120px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">55398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Crystalbond 509-3 Epoxy</td>
			<td style="width:120px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:133px;">821-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CTAnalyser</td>
			<td style="width:120px;">Bruker microCT</td>
			<td style="width:133px;">v.1.15.4.0</td>
			<td>Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dental Tool Kit</td>
			<td style="width:120px;">Amazon</td>
			<td style="width:133px;">787269885110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Diamond wafering saw blade for composite material</td>
			<td style="width:120px;">Buehler</td>
			<td style="width:133px;">#11-4247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Drill Press</td>
			<td style="width:120px;">Jet Mill/Drill</td>
			<td style="width:133px;">350017</td>
			<td>Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fine-tipped forceps</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill</td>
			<td style="width:120px;">MSC Industrial Supply</td>
			<td style="width:133px;">#04804571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:120px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:133px;">26005</td>
			<td>75x50mm slides, 1mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass slide chuck</td>
			<td style="width:120px;">Buehler</td>
			<td style="width:133px;">#112488</td>
			<td>Large enough to hold 75x50mm glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Hot plate capable of reaching 140 &#176;C</td>
			<td style="width:120px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:133px;">HP88850105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Incubator</td>
			<td style="width:120px;">NAPCO</td>
			<td>Model 4200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Isocut Fluid</td>
			<td style="width:120px;">Buehler</td>
			<td style="width:133px;">111193032</td>
			<td>Lubricant; 30mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Jeweler&#39;s diamond coring drill bit</td>
			<td style="width:120px;">Otto Frei</td>
			<td style="width:133px;">#119.050</td>
			<td>2mm inner diameter hollow stem coring bit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">NRecon</td>
			<td style="width:120px;">Bruker microCT</td>
			<td style="width:133px;">v.1.6.10.2</td>
			<td>Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Oscillating saw</td>
			<td style="width:120px;">Harbor Freight</td>
			<td style="width:133px;">62866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Oven-safe glass dishes</td>
			<td style="width:120px;">Pyrex</td>
			<td style="width:133px;">1117715</td>
			<td>Glass food storage container</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Precision slow-speed saw (Isomet 1000)</td>
			<td style="width:120px;">Buehler</td>
			<td style="width:133px;">111280160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Razor blades</td>
			<td style="width:120px;">Amazon</td>
			<td style="width:133px;">25181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Shallow aluminum tins</td>
			<td style="width:120px;">Amazon</td>
			<td style="width:133px;">B01MRWLD0R</td>
			<td>~8cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Specimen cups</td>
			<td style="width:120px;">Amazon</td>
			<td style="width:133px;">616784425436 885334344729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tergazyme detergent</td>
			<td style="width:120px;">Alconox</td>
			<td style="width:133px;">1304-1</td>
			<td>1.8kg box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:120px;">MTI Corporation</td>
			<td style="width:133px;">KJ201508006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sectioning, coring, and image processing guide for high-throughput cortical bone sample procurement and analysis for synchrotron micro-ct

O osso é um tecido dinâmico e mecanicamente ativo que muda de estrutura ao longo da vida humana. Os produtos do processo de remodelação óssea foram estudados substancialmente utilizando técnicas bidimensionais tradicionais. Os recentes avanços na tecnologia de imagem de raios-X por meio da tomografia microcomputante de desktop (μCT) e da tomografia microcomputante de radiação síncrotron (SRμCT) permitiram a aquisição de varreduras tridimensionais de alta resolução (3D) de um campo de visão maior (FOV) do que outras técnicas de imagem 3D (por exemplo, SEM) fornecendo uma imagem mais completa de estruturas microscópicas dentro do osso cortical humano. A amostra deve ser centrada com precisão dentro do FOV, no entanto, para limitar o aparecimento de artefatos de raia conhecidos por impactar a análise de dados. Estudos anteriores relataram a aquisição de blocos ósseos retilineares de forma irregular que resultam em artefatos de imagem devido a bordas irregulares ou truncação de imagem. Aplicamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter amostras de núcleo ósseo cortical de tamanho consistente para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método de coring é eficiente e minimamente destrutivo para o tecido. Ele cria amostras cilíndricas uniformes que diminuem artefatos de imagem por natureza de ser isométrico durante a rotação e fornecendo um comprimento de caminho uniforme para raios-X durante a varredura. O processamento de imagens de dados tomográficos de raios-X de amostras cored e de forma irregular confirma o potencial da técnica para melhorar a visualização e análise da microarquitetura óssea cortical. Um objetivo deste protocolo é fornecer um método confiável e repetível para a extração de núcleos ósseos corticais que são adaptáveis para vários tipos de experimentos de imagem óssea de alta resolução. Um objetivo abrangente do trabalho é criar uma aquisição padronizada de ossos cortical para SRμCT que seja acessível, consistente e simples. Esse procedimento pode ser adaptado ainda por pesquisadores de áreas relacionadas que comumente avaliam materiais compostos duros, como na antropologia biológica, geociências ou ciências materiais.

O método descrito de amostragem do núcleo mostrou-se altamente eficaz e eficiente. Os espécimes de coring usando este protocolo permitiram a aquisição de amostras de >300 consistentemente dimensionadas para experimentos na linha de feixe CLS BMIT-BM2, com um FOV de ~2 mm a 1,49 μm de tamanho voxel. Para validar a consistência do diâmetro do núcleo, foram realizadas três medidas ao longo do comprimento (superior, médio, inferior) de um subconjunto de núcleos femorais anteriores humanos ...

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A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Utilizamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter espécimes de osso cortical de tamanho uniforme para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método é minimamente destrutivo, eficiente, resulta em espécimes cilíndricos que minimizam artefatos de imagem de formas de amostra irregulares e melhora a visualização e análise microarquitetural.

Um guia de processamento de imagens e secção, coring e imagem para aquisição e análise de amostras de ossos cortical de alto rendimento para micro-CT síncrotron

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

a-sectioning-coring-image-processing-guide-for-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

5.0K visualizações.  The University of Akron. Utilizamos um protocolo de amostragem geológica (coring) para obter espécimes de osso cortical de tamanho uniforme para experimentos SRμCT do aspecto anterior da femora humana. Este método é minimamente destrutivo, eficiente, resulta em espécimes cilíndricos que minimizam artefatos de imagem de formas de amostra irregulares e melhora a visualização e análise microarquitetural.

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

A tela de elevada capacidade para Biomining Atividade da celulase de Bibliotecas metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biologia

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

Preparação de adultos Drosophila Olhos de Seccionamento Fino e análise microscópica

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Um Guia Prático para Phylogenetics para não especialistas

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

De alta capacidade Análise de Imagem de esferóides tumorais: uma aplicação de software de fácil utilização para medir o tamanho de esferóides automaticamente e com precisão

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...