A pesquisa foi apoiada pela NHLBI Research Scientist Development Grant (1K01HL135461-01) para a JAG. Obrigado a David Carmona-Berrio e Isabel Adarve-Rengifo por sua assistência técnica.

Os camundongos foram alojados e atendidos na Divisão de Cuidados com Animais do Centro Médico da Universidade Vanderbilt (VUMC) seguindo as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA. Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da VUMC antes do início dos experimentos.
1. Preparação e dissecção animal
<ol><li>Ligue o germinador e a bomba de água da almofada de aquecimento cerca de 30 minutos antes de iniciar a cirurgia.</li>
	<li>Corte tubo de poliuretano de 0,5 mm de comprimento com um bisturi afiado. Remova 0,2 mm da circunferência fazendo um corte longitudinal para fazer uma braçadeira. NOTA: Esta é uma parte crítica do procedimento de estenose da artéria renal que requer extrema precisão, atenção aos detalhes e paciência. Tente cortar vários pedaços de tubos de poliuretano de cada vez. Realize todo este procedimento sob microscópio.</li>
	<li>Antes de prosseguir, coloque luvas cirúrgicas estéreis e uma máscara cirúrgica.</li>
	<li>Use ratos C57BL/6 (WT) de 6-8 semanas. Use um número igual de ratos machos e fêmeas para evitar qualquer viés sexual.</li>
	<li>Grave o peso dos camundongos antes de realizar a cirurgia. O peso ideal para realizar estenose da artéria renal com tubo de poliuretano é de 18 a 22 g. Manuseie os ratos suavemente e não se agite ao injetar a anestesia. Administrar analgesia pré-operatória (Ketofgen, 5 mg/kg de musculação corporal). NOTA: Ao transferir os ratos de sua sala de alojamento para a sala de cirurgia, leve-os com grande gentileza e cuidado para evitar agitação. Carregar gaiolas de ratos nas mãos em vez de um carrinho é altamente recomendado.</li>
	<li>Anestesiar os camundongos com uma mistura de cetamina (100 mg/kg BW) e xilazina (10 mg/kg BW) através de injeções intraperitoneais (I.P.).</li>
	<li>Coloque o mouse de volta dentro da gaiola até anestesiar completamente. Leva cerca de 4-5 minutos antes que o rato esteja totalmente inconsciente. Aperte a cauda ou o dedo do pé com fórceps para verificar se o rato está totalmente inconsciente e pronto para a cirurgia.</li>
	<li>Coloque o rato de costas em uma toalha de papel. Remova o cabelo do abdômen lateral usando um cortador de cabelo elétrico seguindo a direção oposta do crescimento capilar. Após raspar o local cirúrgico, limpe a área com um esfoliante cirúrgico contendo iodo (ou clorexidina), seguido de uma lavagem com 70% de etanol (ou soro fisiológico estéril).  Repita 3 vezes. NOTA: O procedimento de depilação deve ser realizado a alguma distância ou preferencialmente em um banco diferente do banco do procedimento cirúrgico para evitar qualquer interferência capilar e contaminação capilar durante o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Cubra a almofada de aquecimento com uma folha estéril. Leve o mouse para o banco cirúrgico e coloque na folha estéril, de frente para o lado lateral direito do mouse em direção ao microscópio. Mantenha uma temperatura constante da almofada de 37 °C com água circulante.</li>
	<li>Abra o saco esterilizado contendo todo o equipamento cirúrgico. Usando um microscópio dissecando e uma tesoura afiada estéril, faça uma pequena incisão flanco (perto da costela torácica de13º , a última costela no rato) e cerca de 0,5 cm de distância das vértebras. Prossiga ao longo das vértebras lombares e faça uma incisão de 1 polegada.</li>
	<li>Puxe a pele e o músculo para expor o rim.</li>
	<li>Limpe e remova a gordura circundante usando cotonetes estéreis para isolar a artéria renal. Isole o nervo renal da artéria renal usando fórceps curvos.</li>
	<li>Ao realizar a cirurgia falsa, aplique suturas para fechar a pele e aplicar antibiótico na ferida fechada, em seguida, prossiga para cuidados pós-operatórios. Se não, prossiga com a seguinte seção para stenose a artéria. NOTA: Todo experimento deve ter animais falsos como controles do procedimento cirúrgico. Animais falsos consistem em camundongos que passaram pelo procedimento cirúrgico de expor a artéria renal sem colocar uma braçadeira sobre ela.</li>
</ol>2. Estenose da artéria renal direita
<ol><li>Coloque duas suturas de nylon sob a artéria renal direita, faça nós soltos e, em seguida, coloque o manguito ao redor da artéria renal principal aproximadamente equidistante entre o rim e a bifurcação da aorta</li>
	<li>Feche a braçadeira usando as suturas de nylon. Faça quatro nós para cada sutura para evitar a probabilidade de perder as suturas após a cirurgia.</li>
	<li>Feche a incisão no músculo aplicando uma sutura contínua simples.</li>
	<li>Faça suturas simples interrompidas para fechar a pele.</li>
	<li>Administrar analgésicos aprovados pela IACUC. NOTA: Ferramentas cirúrgicas autoclave antes de cada uso. Se mais de uma cirurgia estiver sendo realizada de uma só vez, limpe todas as ferramentas usadas com um medidor de álcool estéril e coloque-as em germinadores quentes para 15-30 s após cada cirurgia. Troque luvas estéreis também para cada rato.</li>
</ol>3. Cuidados pós-operatórios
<ol><li>Voltem os ratos para sua gaiola e deixem a gaiola meio em frente, meio fora, uma almofada de aquecimento de água circulante por 2 - 3 horas. Adicione alimentos de recuperação da dieta gel dentro da gaiola.</li>
	<li>Administrá-lo com analgésico (cetoprofeno) intraperitoneal (dose: 5 mg/kg BW) no dia seguinte.</li>
	<li>Pesar os ratos pelos próximos dois dias; se alguns camundongos perderem mais de 20% de seu peso consultar o veterinário e decidir se o animal precisa ser eutanizado após o procedimento autorizado pela IACUC.</li>
	<li>Monitore os camundongos diariamente para avaliar vermelhidão, inchaço, dor ou infecção.</li>
	<li>Procure consulta veterinária para complicações pós-operatórias de acordo com as políticas institucionais da IACUC..</li>
</ol>4. Colheita de tecidos
<ol><li>Colher tecido 3 semanas após o procedimento cirúrgico. Grave o peso de cada rato.</li>
	<li>Eutanize o mouse com um procedimento aprovado pela IACUC.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma plataforma estéril em posição supina para dissecar.</li>
	<li>Segure e estenda os membros para limitar o movimento.</li>
	<li>Pulverize minuciosamente os ratos com 70% de etanol.</li>
	<li>Faça uma incisão midline para abrir o abdômen e a área do peito usando uma tesoura afiada.</li>
	<li>Puxe a pele e a parede peritoneal.</li>
	<li>Exponha cuidadosamente o coração e perfure o ventrículo direito e exsanguine o rato.</li>
	<li>Remova ambos os rins usando fórceps. Os rins estão localizados na parte de trás dos ratos. NOTA: Não misture os dois rins. Esteja ciente dos rins estenosed, falso e contralateral.</li>
	<li>Remova a cápsula renal, limpe-as de qualquer gordura e grave o peso de cada rim separadamente.</li>
	<li>Corte uma seção longitudinal de ambos os rins e fixada em 4% pfa durante a noite a 4 °C para ser posteriormente processada para incorporação de parafina, para realizar em situ hibridização (ISH) e imunohistoquímica (IHC). Siga os protocolos ISH e IHC conforme relatado23,24.</li>
	<li>Isole o córtex do rim restante e o flash congele em nitrogênio líquido para realizar a mancha ocidental. Armazene amostras a -80 °C até a análise.</li>
	<li>Quantifique expressões de renin, e N-GAL com mancha ocidental como descrito na literatura23,24.</li>
</ol>5. Estatísticas
<ol><li>Use ANOVA unidirecional ou bidirecional para experimentos com três ou mais condições seguidas de testes pós-hoc bonferroni para comparações entre grupos individuais. Considere um valor p igual ou inferior a 0,05 significativo. Use software (por exemplo, GraphPad Prism 8.2) para realizar todas as análises estatísticas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kashyap, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+CCR2+reduces+macrophage+influx+and+development+of+chronic+renal+damage+in+murine+renovascular+hypertension.">Blockade of CCR2 reduces macrophage influx and development of chronic renal damage in murine renovascular hypertension.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 310 (5), 372-384 (2016).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+inflammatory+biomarkers+after+renal+revascularization+in+atherosclerotic+renal+artery+stenosis.">Changes in inflammatory biomarkers after renal revascularization in atherosclerotic renal artery stenosis.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 31 (9), 1437-1443 (2016).</li><li>Yerram, P., Karuparthi, P. 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Nenhum conflito de interesses, financeiro ou não, é declarado pelos autores.

A estenose da artéria renal é uma importante causa de hipertensão secundária ou resistente, e lesão renal 1,29. O modelo goldblatt de dois rins (2K1C) foi empregado para estudar a hipertensão renovascular induzida por RAStenosis 1,17,18,19. Vários estudos anteriores utilizando vários modelos de animais mostraram que a estenose na artéria renal é um forte estimulador da superexpressão e liberação de renin, e lesão renal 18,30,31,32,33,34,35. Além disso, este modelo é usado para estudar infiltração de células imunes, fibrose, inflamação e marcadores de lesão renal aguda e crônica29.
Aqui, descrevemos um procedimento detalhado e passo a passo para gerar modelo de estenose arterial renal reprodutível, confiável e consistente em camundongos. Anteriormente, foram empregados clipes metálicos para iniciar a estenose da artéria renal 36,37,38. Como alternativa, utilizou-se tubos redondos de poliuretano (MRE 025; diâmetro interno (ID) = 0,30 mm; diâmetro externo (OD) = 0,63 mm; espessura da parede, (TL) = 0,16 mm). Usamos tubos, uma vez que a colocação de um manguito de poliuretano resultaria em constrição em duas dimensões (constrição) em vez de uma (achatamento), como com um clipe de metal. Além disso, o uso de tubos redondos de poliuretano proporciona uma vantagem da constrição uniforme na artéria renal. O passo crítico e os desafios são cortar o tamanho certo da tubulação de poliuretano, o que requer extrema atenção aos detalhes que devem ser realizados usando um microscópio. Outro critério crítico é manter os camundongos entre 18-22 g para encaixar o tubo na artéria renal. Camundongos dentro desta faixa de peso normalmente têm um diâmetro externo da artéria renal (OD) que está consistentemente dentro do alcance do diâmetro do manguito de tubulação. Uma limitação do método é que ratos pesados (acima de 25 g) ou pequenos (abaixo de 16 g) são difíceis de realizar cirurgia por causa do tamanho do tubo e do manguito feito nele. No entanto, quando necessário, mudanças na tubulação de poliuretano podem ser feitas para acomodar camundongos mais jovens ou mais velhos.
Realizamos estudos de 3 dias e 15 dias para iniciar a estenose da artéria renal em camundongos com cerca de 95% de taxa de sucesso. Em nossa experiência, a indução da estenose da artéria renal usando este método produziu resultados confiáveis, reprodutíveis e consistentes entre os camundongos, independentemente do sexo. Para confirmar a constrição da artéria renal, medimos expressão de renin e lesão renal. Nossos dados sugerem que a expressão de renin aumentou significativamente no rim estenoso.

A estenose da artéria renal (RAStenosis) é um problema intratável que afeta cerca de 6% das pessoas com mais de 65 anos e em até 40% das pessoas com doença vascular coronariana ou periférica 1,2. Os tratamentos atuais para a doença são limitados; portanto, há uma necessidade crítica de desenvolver novas terapias para tratar hipertensão renovascular ou hipertensão resistente induzida por RAStenosis. O sistema de aldosterona de angiotensina renin (RAAS) é o caminho-chave envolvido na patogênese da hipertensão induzida por RAStenose ou hipertensão renovascular 3,4. Terapias conhecidas voltadas para o RAAS, como inibidores de ACE ou bloqueadores de receptores de angiotensina, aliviam a hipertensão, mas precisam de um exame próximo para insuficiência renal e hipercalemia 5,6,7. Renin catalisa o passo limitante de taxas no RAAS; converte angiotensinogênio em angiotensina I. Na aterosclerose, a formação da placa provoca o estreitamento da artéria renal que impulsiona a secreção de renin, resultando em hipertensão renovascular e danos nos rins8. Vários estudos relataram aumento dos níveis de estresse oxidativo durante a hipertensão renovascular em humanos, que foram corroborados com o modelo de dois camundongos de um rim (2K1C), bem como outros modelos animais hipertensos 2,9,10,11,12,13,14,15,16 . O mecanismo molecular de controle de expressão de renin durante a hipertensão renovascular induzida por RAStenosis não é bem compreendido e merece uma investigação mais aprofundada.
Modelos animais experimentais que recapitulam RAStenosis de forma confiável e reprodutiva são importantes na elucidação dos mecanismos celulares e moleculares do controle de expressão de renin para o desenvolvimento de novas terapias. O modelo de camundongo 2K1C é um modelo experimental bem estabelecido para estudar a patogênese da hipertensão renovascular 17,18,19,20. Este modelo é gerado pela constrição da artéria renal utilizando um clipe 17,20,21, produzindo assim oclusão da artéria renal que resulta em um aumento na expressão de renin e hipertensão 17,19,20,21. No entanto, não há relatórios técnicos disponíveis, que descrevam um procedimento passo a passo para gerar estenose da artéria renal em modelos animais.
Clipes de prata convencionais em forma de U, tubos de poliuretano e outros clipes têm sido usados para restringir a artéria renal para induzir estenose da artéria renal. Alguns estudos têm demonstrado que o design e o material do clipe são fundamentais para obter dados confiáveis e reprodutíveis com o modelo animal 2K1C. De acordo com Lorenz et al., o uso de clipes de prata convencionais projetados por U induz uma baixa taxa de sucesso de hipertensão (40-60%)21. Devido ao desenho do clipe, a artéria renal é pressionada lateralmente, desencadeando algumas constrições e maior probabilidade de ser desalojada da artéria renal. Maleabilidade prateada e ductilidade podem permitir alterações nas larguras do clipe; portanto, causando diferentes níveis de hipertensão entre camundongos. Os dióxidos de prata no clipe podem causar inflamação perivascular, proliferação intimal e granulação tecidual, alterando o diâmetro da artéria renal22. Devido à variabilidade nos níveis de hipertensão obtida com o clipe de prata u-design convencional, Warner et al. e Lorenz et al. usaram com sucesso um tubo de poliuretano de design arredondador para iniciar a estenose da artéria renal em camundongos, gerando uma indução mais confiável e consistente dos dois rins um clipe modelo animal20,21.
Neste relatório, descrevemos um protocolo cirúrgico para gerar RAStenosis experimental em camundongos, usando a tubulação de poliuretano para restringir a artéria renal. O manguito de design redondo de poliuretano é um clipe mais reprodutível, confiável e de baixo custo para gerar estenose no mouse. O objetivo deste modelo experimental é estudar e definir o mecanismo molecular e celular do controle da expressão de renin durante a estenose da artéria renal. Confirmamos o sucesso do modelo de camundongos RAStenosis medindo a expressão de renin e o marcador de lesão renal neutrófilo gelatinase-associado lipocalina (N-GAL).

<table><tbody><tr><td>Diet Gel</td><td>Clear H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Diet-Gel 76A</td><td>Surgery recovery diet</td></tr><tr><td>EMC Heated Hard pad</td><td>Hallowell</td><td>000A2788B</td><td>Heating pads were used to keep mice warm</td></tr><tr><td>Ethilon Nylon Suture</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>4-0 (1.5 metric), This suture was used to close the peritoneum, and skin</td></tr><tr><td>Ethilon Nylon Suture</td><td>Ethicon</td><td>2815 G</td><td>8-0 (0.4 metric), This suture was used to close cuff to tie and constrict the artery</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>GER 5287</td><td>Sterilize surgical tools between surgeries</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Zoetis</td><td>Ketofen</td><td>Painkiller</td></tr><tr><td>Polyurethane</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>MRE-025</td><td>This tube was used to initiate stenosis</td></tr><tr><td>Povidone-iodine antiseptic swabsticks</td><td>Medline</td><td>MDS093901</td><td>It was applied after hair removal and surgery on the skin</td></tr><tr><td>Reflex 7 Clip Applier</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>204-1000</td><td>This clip applier was used to apply clip in case one or more sutures went off</td></tr><tr><td>Sterile towel drapes</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>It was used as a bedsheet for mice during surgery</td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment</td><td>Medi-First</td><td>22312</td><td></td></tr><tr><td>Water pump</td><td>Stryker</td><td>T/pump Professionals</td><td>Used to warm and circulate water in the heating hard pad to keep mice warm during and post-surgery</td></tr></tbody></table>

a modified two kidney one clip mouse model of renin regulation in renal artery stenosis

A estenose da artéria renal é uma condição comum em pacientes com doença vascular coronariana ou periférica onde o sistema de aldosterona renin angiotensin (RAAS) é superativado. Nesse contexto, há um estreitamento das artérias renais que estimulam o aumento da expressão e liberação de renin, a protease que limita a taxa no RAAS. O aumento resultante da expressão de renin é um conhecido condutor da hipertensão renovascular, frequentemente associada a lesões renais e danos nos órgãos finais. Assim, há um grande interesse em desenvolver novos tratamentos para essa condição. O mecanismo molecular e celular do controle de renin na estenose da artéria renal não é totalmente compreendido e merece uma investigação mais aprofundada. Para induzir estenose da artéria renal em camundongos, foi desenvolvido um modelo de rato Goldblatt modificado de 2 rins 1 (2K1C). O rim direito foi estenoso em camundongos do tipo selvagem e camundongos operados por vergonha foram usados como controle. Após estenose da artéria renal, determinamos expressão de renin e lesão renal. Os rins foram colhidos, e cortices frescos foram usados para determinar a expressão proteica e mRNA de renin. Este modelo animal é reprodutível e pode ser usado para estudar respostas fiofoficológicas, vias moleculares e celulares envolvidas na hipertensão renovascular e lesão renal.

A constrição da artéria renal aumenta a expressão de renin no rim estenoso enquanto reprime a expressão no rim contralateral. O dois rim um clipe (2K1C) ou modelo Goldblatt de estenose induz aumento da expressão renin e lesão renal. Este é reconhecido como o melhor modelo representativo de estenose unilateral da artéria renal em humanos.
A expressão de renin e prorenina (precursora da renin) foram medidas utilizando-se imunoblotting. Os dados mostram que a expressão de renin e prorenina aumentou no rim estenoso comparando com rins contralaterais e falsos, sugerindo que a braçadeira estava restringindo a artéria renal causando alterações na perfusão renal (Figura 1). Para visualizar a localização da expressão renin, foi realizado o IHC. IHC corroborou dados de imunoblotação mostrando aumento da expressão de renin no rim cortado (Figura 2). Além disso, o recrutamento de células justaglomerulares (JG) ao longo da arteriola aferente foi visto no rim estenoso (Figura 2). Para investigar o efeito sobre os níveis de expressão de renin mRNA, foi realizado o ISH. Os dados do ISH sugerem o aumento do recrutamento de células renin mRNA e JG no rim estenose quando comparado com rins contralaterais e falsos (Figura 3).
Outra característica da estenose da artéria renal é a regulação dos marcadores de lesão renal devido a alterações na perfusão renal, produção de superóxido e hipertensão 2,25,26. A lipocalina associada à gelatina neutrófila (NGAL) é um marcador de lesão aguda bem caracterizado e é superexpressa durante a lesão renal27,28. Portanto, o marcador de lesão renal aguda NGAL foi medido por meio de imunoblotação. Os dados de imunoblotting mostraram que a N-GAL foi altamente regulamentada no rim estenose quando comparada aos rins contralateral e falso (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61058/61058fig01.jpg"> Figura 1: Expressão renin. Após 15 e 3 dias de estenose da artéria renal, os camundongos foram eutanizados. Rins foram colhidos, e a expressão renin foi determinada pela mancha ocidental. (A) está mostrando imagens representativas de manchas ocidentais de 15 dias de stenosed (painel esquerdo) e ratos falsos (painel direito). (B) está mostrando a análise densitométrica das bandas proteicas prorenina (painel esquerdo) e renin (painel direito). Beta-actin foi usado como controle de carregamento. (C) está mostrando as imagens representativas das manchas ocidentais de 3 dias (painel esquerdo) e ratos falsos (painel direito). (D) está mostrando análise densitométrica de bandas proteicas de prorenina (painel esquerdo) e renin (painel direito). Beta-actin foi usado como controle de carregamento. Os dados são apresentados como a média ± valor SD. P calculado com ANOVA bidirecional seguido pelo teste pós-hoc de Tukey. *P<0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, N=3-6. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61058/61058fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61058/61058fig02.jpg"> Figura 2: Análise imunohistoquímica para visualização e localização da expressão de renin após estenose da artéria renal. Os rins foram isolados após eutanásia de camundongos de estenose da artéria renal de 3 dias. Uma peça do corte longitudinal de todo o rim foi fixada com 4% de solução de formalina tamponada neutra, depois dessa desidratada em uma série de etanol graduado, e embutida em parafina. A coloração verde representa a expressão da proteína renin; azul, núcleos. (A) Imagens representativas de microscopia de rim estenose (lado esquerdo), rim contralateral (lado direito) de camundongos estenosos. (B) Imagens representativas de microscopia de rim falso (lado esquerdo) e rim contralateral (lado direito) de camundongos falsos. Barra de escala 30 mícrons. Ampliação de 90X. (C) Imagens representativas de microscopia de rim estenose (lado esquerdo), rim contralateral (lado direito) de camundongos estenosos. (D) Imagens representativas de microscopia de rim falso (lado esquerdo) e rim contralateral (lado direito) de camundongos falsos. Essas imagens foram tiradas principalmente da região do córtex. Barra de escala 50 μm. 15x de ampliação. Círculos pontilhados brancos denotam a localização de glomeruli. G: Glomeruli, AfAr: Arteriole Afferent, N=4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61058/61058fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61058/61058fig03.jpg"> Figura 3: Análise de hibridização in situ da expressão renin mRNA após estenose da artéria renal. Após 3 dias de estenose da artéria renal, os camundongos foram eutanizados e os rins foram isolados e fixados por perfusão com 4% de solução de formalina tamponada neutra, desidratada em uma série de etanol graduado, e incorporada na parafina. A hibridização in situ foi realizada seguindo as instruções do fabricante. A coloração vermelha escura representa a expressão mRNA renin; azul, núcleos. (A) . Imagem representativa de microscopia de rins estenosos (lado esquerdo) e rim contralateral (lado direito) de camundongos estenosos. (B) . Imagem representativa de microscopia de rim falso (lado esquerdo) e rim contralateral (lado direito) de camundongos falsos. Barra de escala 50 μm. Círculos pontilhados brancos denotam glomeruli expressando renin. G: Glomeruli, AfAr: Arteriole Afferent, N=4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61058/61058fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61058/61058fig04.jpg"> Figura 4: Expressão de lipocalina associada à gelatinase de nêutrons (N-GAL) após estenose da artéria renal. Após 3 dias de estenose da artéria renal, os camundongos foram eutanizados e os rins foram colhidos, e a expressão N-GAL medida por mancha ocidental. (A) O representante ocidental mancha imagens de 3 dias de stenosed (painel esquerdo) e ratos falsos (painel direito). Beta-actin foi usado como controle de carregamento. (B) Análise densitométrica das bandas N-GAL. Os valores de densidade proteica de N-GAL foram normalizados para β-actin. Os dados são apresentados como a média ± valor SD. P calculado com ANOVA bidirecional seguido pelo teste pós-hoc de Tukey. **P<0,01, ***P< 0,001, N=3-5. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61058/61058fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis

Um modelo modificado de 2 rim 1 (2K1C) O modelo de rato Goldblatt foi desenvolvido usando tubos de poliuretano para iniciar a estenose da artéria renal, induzindo um aumento na expressão de renin e lesão renal. Aqui, descrevemos um procedimento detalhado de preparação e colocação da braçadeira na artéria renal para gerar um modelo de mouse 2K1C reprodutível e consistente.

Um modelo modificado de rato de dois rins um clipe de regulação de renin em estenose da artéria renal

Renal artery stenosis is a common condition in patients with coronary or peripheral vascular disease where the renin angiotensin aldosterone system (RAAS) ...

a-modified-two-kidney-one-clip-mouse-model-renin-regulation-renal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

4.6K visualizações.  Vanderbilt University Medical Center. Um modelo modificado de 2 rim 1 (2K1C) O modelo de rato Goldblatt foi desenvolvido usando tubos de poliuretano para iniciar a estenose da artéria renal, induzindo um aumento na expressão de renin e lesão renal. Aqui, descrevemos um procedimento detalhado de preparação e colocação da braçadeira na artéria renal para gerar um modelo de mouse 2K1C reprodutível e consistente.

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Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase 1. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% 4. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy 5. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI 6. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis 6.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality 1. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed 3, 7-9. 
To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required 7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle 14. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

A precise murine model for acute kidney injury (AKI) due to ischemia is an important tool to investigate acute kidney injury and possibly find therapeutic tools to treat renal injury. The hanging weight system offers a tool for immediate and reliable renal artery occlusion and reperfusion without causing renal congestion.

Uso de um sistema de suspensão de peso para oclusão da artéria renal isolada

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

Medicina

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable during renal transplantation. Experimental models that accurately and reproducibly recapitulate renal IRI are crucial in dissecting the pathophysiology of AKI and the development of novel therapeutic agents. Presented here is a mouse model of renal IRI that results in reproducible AKI. This is achieved by a midline laparotomy approach for the surgery with one incision allowing both a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia of the left kidney. By careful monitoring of the clamp position and body temperature during the period of ischaemia this model achieves reproducible functional and structural injury. Mice sacrificed 24 hr&#160;following surgery demonstrate loss of renal function with elevation of the serum or plasma creatinine level as well as structural kidney damage with acute tubular necrosis evident. Renal function improves and the acute tissue injury resolves during the course of 7 days following renal IRI such that this model may be used to study renal regeneration. This model of renal IRI has been utilized to study the molecular and cellular pathophysiology of AKI as well as analysis of the subsequent renal regeneration.

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Renal Isquemia Reperfusão: um modelo do rato de lesão e regeneração

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Avaliação transcutânea da função renal em roedores conscientes

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

An Effective Mouse Model of Unilateral Renal Ischemia-Reperfusion Injury

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models are the only available resources that mimic the complexities of the IRI-associated damage encountered in vivo. This paper describes an effective mouse model of unilateral renal IRI that delivers highly reproducible data. Ischemia is induced by occluding the right renal pedicle for 30 min followed by reperfusion. In addition to the surgical procedure, a sequential overview of the expected physiological and histopathological changes following renal IRI will be provided by comparing data from seven different reperfusion times (4 h, 8 h, 16 h, 1 day, 2 days, 4 days, and 7 days). Critical data for planning experiments ahead, such as mean surgical time, average anesthetic consumption, and body weight changes over time, will be shared. This work will help researchers implement a reliable renal IRI model and select the appropriate reperfusion time that aligns with their intended investigative goals.

Renal ischemia-reperfusion injury is associated with high morbidity and mortality in hospitalized patients. Here, we present a simple and effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury and provide a sequential overview of representative pathological changes observed in the kidney.

Um modelo eficaz de rato de isquemia renal unilateral-reperfusão lesão

Ischemia-reperfusion injury (IRI) is the leading cause of acute renal failure and is a significant contributor to delayed graft function. Animal models ...

Improved Renal Denervation Mitigated Hypertension Induced by Angiotensin II Infusion

The benefits of renal sympathetic denervation (RDN) on blood pressure have been proved in a large number of clinical trials in recent years. However, the regulatory mechanism of RDN on hypertension remains elusive. Thus, it&#39;s essential to establish a simpler RDN model in mice. In this study, osmotic mini pumps filled with Angiotensin II were implanted in 14-week-old C57BL/6 mice. One week after the implantation of the mini-osmotic pump, a modified RDN procedure was performed on bilateral renal arteries of the mice using phenol. Age-sex-matched mice were given saline and served as sham group. Blood pressure was measured at baseline and every week subsequently for 21 days. Then, renal artery, abdominal aorta and heart were collected for histological examination using H&#38;E and Masson staining. In this study, we present a simple, practical, repeatable, and standardized RDN model, which can control hypertension and alleviate cardiac hypertrophy. The technique can denervate peripheral renal sympathetic nerves without renal artery damage. Compared to previous models, the modified RDN facilitates the study of the pathobiology and pathophysiology of hypertension.

Here, we present a protocol for renal sympathetic denervation (RDN) in mice with hypertension induced by Angiotensin II infusion. The procedure is repeatable, convenient and allows to study the regulatory mechanisms of RDN on hypertension and cardiac hypertrophy.

Denervação renal melhorada Hipertensão Mitigada Induzida por Infusão de Angiotensina II

The benefits of renal sympathetic denervation (RDN) on blood pressure have been proved in a large number of clinical trials in recent years. However, the ...

A Murine Model of Hemodialysis Access-Related Hand Dysfunction

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement therapies such as hemodialysis continues to increase. Autogenous arteriovenous fistula (AVF) placement remains a primary vascular access option for ESRD patients. Unfortunately, approximately half of the hemodialysis patients experience dialysis access-related hand dysfunction (ARHD), ranging from subtle paresthesia to digital gangrene. Notably, the underlying biologic drivers responsible for ARHD are poorly understood, and no adequate animal model exists to elucidate the mechanisms and/or develop novel therapeutics for the prevention/treatment of ARHD. Herein, we describe a new mouse model in which an AVF is created between the left common iliac artery and vein, thereby facilitating the assessment of limb pathophysiology. The microsurgery includes vessel isolation, longitudinal venotomy, creation of arteriovenous anastomosis, and venous reconstruction. Sham surgeries include all the critical steps except for AVF creation. Iliac AVF placement results in clinically relevant alterations in central hemodynamics, peripheral ischemia, and impairments in hindlimb neuromotor performance. This novel preclinical AVF model provides a useful platform that recapitulates common neuromotor perturbations reported by hemodialysis patients, allowing researchers to investigate the mechanisms of ARHD pathophysiology and test potential therapeutics.

This protocol details the surgical steps of murine common iliac arteriovenous fistula creation. We developed this model to study hemodialysis access-related limb pathophysiology.

Um modelo murino de disfunção da mão relacionada ao acesso para hemodiálise

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Biologia

A Mouse 5/6th Nephrectomy Model That Induces Experimental Uremic Cardiomyopathy

Chronic kidney disease (CKD) is a great risk factor for cardiovascular disease events and mortality, and progressively develops to the clinical phenotype called "uremic cardiomyopathy". We describe here an experimental CKD mouse model, named 5/6th partial nephrectomy (PNx) with pole ligation, which developed uremic cardiomyopathy at four weeks post-surgery. This PNx model was performed by a two-step surgery. In step-one surgery, both poles of the left kidney were ligated. In step-two surgery, which was performed 7 days after the step-one surgery, the right kidney was removed. For the sham surgery, the same surgery procedures were performed but without pole ligation of the left kidney or removal of the right kidney. The surgical procedures are easier and less time-consuming, compared to other methods. However, the remnant functional renal mass is not as easily controlled as the renal artery ligation. Four weeks after surgery, in comparison with the sham-operated mice, the PNx mice developed impaired renal function, anemia, cardiac hypertrophy, cardiac fibrosis, and decreased heart systolic and diastolic function.

A Mouse 5/6th Nephrectomy Model That Induces Experimental Uremic Cardiomyopathy

This manuscript provides a detailed two-step surgical procedure to perform mouse 5/6th partial nephrectomy (PNx) with pole ligation. Four weeks after surgery, in comparison with sham-operated mice, the PNx mice developed impaired renal function, anemia, cardiac hypertrophy, cardiac fibrosis, and decreased heart systolic and diastolic function.

Um Mouse 5/6th nefrectomia modelo que induz a miocardiopatia urêmica Experimental

Chronic kidney disease (CKD) is a great risk factor for cardiovascular disease events and mortality, and progressively develops to the clinical phenotype ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nefrectomia 5/6 padronizada em ratos para insuficiência renal e má perfusão

5/6 Nephrectomy Using Sharp Bipolectomy Via Midline Laparotomy in Rats

Chronic kidney disease (CKD) affects over 10% of the global population, amounting to more than 800 million individuals worldwide. The advances in the treatment of CKD have had a significant impact on patient outcomes. While in the past, CKD was often considered a death sentence, with many patients succumbing to the complications of end-stage renal disease, it is now increasingly being managed as a chronic condition with the availability of dialysis and kidney transplantation, as well as new pharmaceutical developments such as SGLT2 inhibitors or nonsteroidal mineralocorticoid receptor antagonists. 
Yet, there continues to be a growing demand for further exploration into the pathophysiological processes and potential therapeutic interventions. Reliable biological models play a crucial role in facilitating this research. Given the multifaceted nature of renal disease, which encompasses not only cell biology but also vascular microanatomy and endocrine signaling, an appropriate model must possess a level of biological complexity that only an animal model can offer, rendering rodents an obvious choice.
This manuscript, therefore, provides an intricate, systematic protocol for surgically reducing renal parenchyma through midline laparotomy and combined total and partial nephrectomy in rats for survival as well as non-survival applications. It emphasizes the critical role of precise surgical techniques in ensuring consistent and reliable outcomes. Prime examples of potential applications for this model include biomolecular and pharmaceutical studies as well as the development of innovative intraoperative imaging modalities, such as hyperspectral imaging, to objectively visualize and differentiate renal malperfusion.

<meta charset="utf8"></head><body>Nefrectomia 5/6 usando bipolectomia afiada via laparotomia de linha média em ratos

This manuscript introduces a standardized protocol for a 5/6 nephrectomy by sharp bipolectomy via midline laparotomy in a rat model, aiming to induce a state of renal insufficiency via renal parenchyma reduction with a great degree of methodical precision and low risk of technical error.

Nefrectomia 5/6 usando bipolectomia afiada via laparotomia de linha média em ratos

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