A pesquisa de biologia do macrófago humano tem sido limitada porque depende da coleta de células de doadores. Este protocolo mostra um método no qual podemos produzir macrófagos humanos a partir de células-tronco pluripotentes em laboratório. Este é um protocolo robusto que pode ser dimensionado para produzir macrófagos em grandes quantidades para terapias celulares ou pesquisa.
Células-tronco pluripotentes podem ser geneticamente manipuladas. Assim, neste protocolo, podemos gerar macrófagos com um fenótipo específico, tags fluorescentes, e também macrófagos para modelar estados de doença. A demonstração visual deste protocolo é útil porque o uso da ferramenta de passagem fácil não será familiar para muitos pesquisadores.
Além disso, o nível de cuidado necessário ao repor a mídia e as células de colheita é difícil de colocar em palavras. Quando as células cultivadas atingirem 80% de confluência, substitua o meio de cultura gasto por 1,5 mililitros de meio fresco. Segurando o vaso de cultura em uma mão, role uma ferramenta de passagem de celular descartável através da placa em uma direção.
Todas as lâminas do rolo devem estar tocando a placa. Mantenha a pressão uniforme enquanto rola. Repita rolando na mesma direção até que todo o poço tenha sido coberto.
Gire o vaso cultural 90 graus e repita o rolamento. Com uma pipeta estéril, use mídia no poço para desalojar colônias cortadas. Aspire CELLstart e substitua a mídia.
Transferir células em uma proporção de um para quatro para poços pré-revestidos preparados como descrito no manuscrito. Para iniciar o processo de diferenciação no dia zero, adicione 2,25 mililitros de mídia estágio um em dois poços de uma placa de seis poços de fixação ultra baixa. Em seguida, para um poço 80% confluente de iPSCs em uma placa de seis poços, substitua a mídia de manutenção por 1,5 mililitros de mídia estágio um.
Corte colônias usando uma nova ferramenta de passagem celular. Usando uma pipeta, transfira as colônias cortadas para os dois poços da placa de seis poços de fixação ultra baixa. No segundo dia, ajuste as concentrações de citocinas adicionando 0,5 mililitros de mídia HESC SFM à placa de seis poços contendo o dia dois corpos embrionários.
No quarto dia, cubra quatro poços de uma placa de cultura de tecido de seis poços com 0,1% de gelatina. Depois de incubar por pelo menos 10 minutos, retire a gelatina e adicione 2,5 mililitros de mídia estágio dois. Colete corpos embrióides formados dos dois poços de uma placa de seis poços e coloque-os em um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Permita que eles se instalem na parte inferior do tubo pela gravidade. Em seguida, aspire cuidadosamente a mídia do tubo e resuspenda os corpos embrionários em dois mililitros da mídia estágio dois. Transfira de 10 a 15 corpos embrionários para um poço revestido de gelatina contendo 2,5 mililitros de mídia estágio dois e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Por duas a três semanas, mude a mídia a cada três ou quatro dias. O revestimento dos EBs é crucial. Ter menos de 10 ou mais de 15 EBs ou distribuí-los de forma desigual pode levar a baixos rendimentos de macrófagos.
Após duas a três semanas, os corpos embrionários começam a liberar células hematopoiéticas não aadeirentes em suspensão. Usando um coador de 40 micrômetros, colete essas células em um tubo de 50 mililitros e reabastecer a mídia. Centrifugar a suspensão de células hematopoiéticas a 200 vezes g por três minutos.
Resuspend as células hematopoiéticas na mídia estágio três. Em seguida, aplaque as células a uma densidade de 0,2 vezes 10 a sexta células por mililitro. Mude a mídia do estágio três a cada cinco dias.
Após nove a 11 dias, os macrófagos serão totalmente diferenciados e totalmente funcionais. Adicione oito vezes 10 ao quarto macrófago derivado do iPSC em 200 microliters de mídia estágio três para cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione 100 microliters de solução de contas a cada poço contendo macrófagos derivados do iPSC.
Use um sistema de imagem de alto conteúdo para imagem da placa. Adquira três ou mais campos em cada poço para obter uma boa representação. Colônias iPSC, corpos embrionários, células de suspensão hematopoiéticas e macrófagos maduros eram morfologicamente distintos.
Os macrófagos derivados do iPSC eram grandes, tinham núcleos pequenos em forma oval e tinham citoplasma abundante contendo muitas vesículas. O fenótipo macrófago foi avaliado por citometria de fluxo. Macrófagos derivados do iPSC maduros expressaram o marcador de linhagem CD45 e o marcador de maturação do macrófago 25F9 e foram negativos para o marcador de macrófago imaturo monocyte CD93.
Macrófagos derivados do iPSC expressaram vários marcadores mieloides de linhagem e foram positivos para o marcador de modulação imunológica CD86. Uma pequena proporção dos macrófagos expressou receptores de quimioterapia CX3CR1, CCR2, CCR5 e CCR8. A capacidade fagocítica iPSC-DM foi avaliada por meio de biopartículas e um sistema de imagem de alto teor de conteúdo.
As biopartículas não foram fluorescentes quando adicionadas às culturas macrófagos, mas após a fagocitose fluoresced verde brilhante no pH ácido intracelular. A fração fagocítica representa a proporção de macrófagos que fagociado biopartículas e o índice fagocítico é a medida do número de biopartículas que cada macrófago ingeriu. Macrófagos podem mudar fenótipo em resposta a pistas ambientais.
O RT-PCR foi usado para quantificar a expressão mRNA regulamentada dos genes. Macrófagos tratados com LPS e interferon gama ou IL4 apresentaram uma porcentagem significativamente menor de células fagocíticas quando comparados com macrófagos ingênuos. Macrófagos tratados com IL10 apresentaram aumento no percentual de células fagocíticas e aumento do índice fagocítico.
Este protocolo poderia ser usado para fornecer uma fonte de células fora da prateleira para tratar doenças como doenças hepáticas crônicas onde macrófagos têm se mostrado terapêuticos em modelos animais. Macrófagos derivados do iPSC podem ser usados para estudar macrófagos associados a vários estados da doença. Por exemplo, usamos essas células para estudar macrófagos associados a tumores no câncer de mama.
Modificamos o fenótipo de macrófagos derivados do iPSC por programação genética usando um único fator de transcrição chamado KLF1. Com isso, produzimos macrófagos que parecem macrófagos da ilha eritrópica e eles forneceram insights sobre a produção e maturação de glóbulos vermelhos.
