Os receptores P2X7 são extremamente versáteis e funcionam de forma diferente, dependendo da quantidade de agonista presente. Desta forma, o P2X7 tem funções diferentes e pode regular a fisiologia de muitos sistemas diferentes. Este protocolo permite a investigação das três principais funções do receptor P2X7.
É um método rápido, reprodutível e quantificável para entender sua função. Nosso foco em como os receptores P2X7 podem modular em células progenitoras neurais. No entanto, este método pode ser facilmente adaptado para se adequar a qualquer tipo de célula.
Os alunos que leram literatura suficiente antes de tentar este procedimento podem aprender isso em apenas um dia e ser capaz de executar tudo isso sozinhos depois de duas ou três tentativas. Inicie este procedimento obtendo células progenitoras neurais da zona subventricular e hipocampo de camundongos adultos, conforme descrito no protocolo de texto. Mantenha culturas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Neuroesferas devem se formar após sete a dez dias é a passagem zero cultura da zona subventricular e após 15 a 20 dias na cultura hipocampal. Após a fase inicial de cultura zero, passagem a cada sete a dez dias conforme necessário utilizando um gabinete de segurança biológica e práticas padrão de cultura tecidual. Passagem pelas esferas quando atingirem de 150 a 200 mícrons de diâmetro.
Colete as esferas e o médio em um tubo de 15 mililitros e gire a baixa velocidade por dois minutos. Remova o meio e incuba as células com reagente de dissociação por sete a 10 minutos a 37 graus Celsius, dependendo do tamanho das esferas. Por fim, conte as células usando um hemótmetro ou contador automático de células.
Suspendemos as células únicas em um mililitro de meio de sódio livre de cálcio. Em seguida, carregue as células com dois ninigramas por mililitro de corante indicador de cálcio e 10 microliters de ácido plurônico de 5%. Incubar as células por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Lave as células adicionando de três a cinco mililitros de sódio sem cálcio médio e centrifugando suavemente. Remova o supernasce e suspenda as células em meio de sódio livre de cálcio, lavando uma segunda vez. Suspenda as células em um mililitro de meio de sódio livre de cálcio.
Em seguida, coloque as células no gelo e deixe-as desessuriar por 30 minutos. Lave as células mais uma vez adicionando três a cinco mililitros de meio de potássio e centrifugação como antes. Depois de suspender as células em meio de potássio, eliquate-as em triagem celular ativada por fluorescência ou tubos FACS a uma concentração de um milhão de células por 500 microliters por tubo FACS.
Coloque os tubos FACS no gelo até que as células estejam prontas para serem analisadas. Não deixe as células no gelo por um longo período, mas comece o ensaio o mais rápido possível. Para algumas amostras, pré-incubar as células com inibidor específico do receptor P2X7, conforme descrito no protocolo de texto.
Alguns minutos antes de executar a primeira amostra, adicione cloreto de cálcio a uma concentração final de um mililitro e coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius para se recuperar. Solte um pequeno agitador magnético limpo no tubo FACS e posicione o tubo no módulo de tempo que está ligado a um banho de água de 37 graus Celsius circulante para controlar a temperatura da amostra. Selecione uma velocidade de agitação baixa para garantir o movimento da amostra sem introduzir um efeito vórtice.
Coloque o jarro de água e o adaptador do tubo sobre a plataforma de amostra e feche o braço da alavanca da máquina FACS. Inicie a aquisição da amostra e execute a amostra por três minutos em cerca de 1.000 eventos por segundo. Na marca de 40 segundos, remova rapidamente o tubo e adicione o agonista P2X7.
Ou um ATP milimólar ou 300 micromolar BzATP. Em seguida, substitua o tubo para continuar a aquisição. Enquanto a primeira amostra está gravando, prepare a segunda amostra com cloreto de cálcio.
Coloque-o em 37 graus Celsius para permitir tempo suficiente para as células se aquecerem antes da análise. Uma vez que a primeira amostra tenha terminado, limpe a ingestão executando uma amostra de água. Então a aquisição da segunda amostra pode começar como antes.
Limpe sempre a ingestão entre as amostras. Crie uma suspensão unicelular como antes e salve alguns mililitros do meio condicionado. Use o meio para suspender as células a uma concentração de um milhão de células por 100 microliters por tubo FACS e coloque as células no gelo até ficarem prontas.
Antes de executar o ensaio, adicione 900 microliters de meio de potássio para um volume final de um mililitro. Coloque os tubos em um banho de água de 37 graus Celsius por 10 minutos para se recuperar. Se aplicável, pré-incubar as células com tratamentos incluindo os inibidores específicos P2X7.
Imediatamente antes de executar o ensaio, adicione 25 brometo de etídio micromolar ao tubo FACS. Em seguida, adicione o agitador magnético, coloque o tubo na máquina FACS e comece a aquisição como antes. Para induzir a formação de poros na membrana celular, adicione um ATP milimólar ou 100 micromolar BzATP 40 segundos após o início da aquisição.
Execute as amostras em torno de 1.000 eventos por segundo durante seis minutos. Enquanto a primeira amostra está em execução, pegue a segunda amostra do gelo e coloque-a no banho de água de 37 graus Celsius para permitir tempo suficiente para as células se recuperarem antes da análise. Uma vez concluída a primeira aquisição da amostra e a ingestão foi limpa, a segunda amostra pode ser colocada na máquina para começar a gravar.
Suspendemos as células únicas em médios condicionados e as eliquate-as em tubos FACS a uma concentração de pelo menos um milhão de células por 100 microliters por tubo FACS. Diluir as células para uma concentração final de um milhão de células por mililitro com meio de sódio e colocar as células no gelo até que a análise seja realizada. Use um mínctico de contas G como alvos fagocíticos para ensaios de fagocitose em tempo real.
Antes de executar a primeira amostra, transfira as células para um banho de água de 37 graus Celsius e incuba-as por aproximadamente sete a 10 minutos para permitir que as células se recuperem. Adicione quaisquer tratamentos que exijam pré-incubação aos seus respectivos tubos, incluindo ATP, ATP oxidado, citokelisina D e 4% de paraformaldeído. Não é necessária pré-incubação para soro humano de 5%.
Se os tratamentos forem adicionados aproximadamente ao mesmo tempo, as amostras podem ser executadas consecutivamente, enquanto outras continuam a incubar porque seus tempos de incubação variam. Coloque a amostra no cítômetro com o agitador magnético e inicie a aquisição da amostra como antes. Remova o tubo de amostra da máquina de 15 a 20 segundos após o início da aquisição e adicione cinco microliters de contas YG não diluídas.
Devolva o tubo FACS da amostra ao instrumento e continue a aquisição. Execute as amostras por sete a oito minutos em torno de 1.000 eventos por segundo. Enquanto a primeira amostra está em execução, pegue a segunda amostra do gelo e coloque-a em um banho de água de 37 graus Celsius para permitir tempo suficiente para as células se recuperarem antes da análise.
Uma vez que a primeira amostra em terminado e a ingestão tenha sido limpa, comece a aquisição na segunda amostra. Quando plotado ao longo do tempo, o fluxo de cálcio era geralmente semelhante nas células progenitoras neurais da zona hipocampal e subventricular. Agonistas foram adicionados na 42ª marca.
O BzATP ativa rapidamente os receptores P2X7, abrindo o canal de íons e permitindo o fluxo de cálcio que se liga a fluo-8 e fluoresces. A aplicação de ATP geralmente resulta em um influxo de cálcio mais gradual. Tem uma menor afinidade com p2X7 quando comparado ao BzATP e também resultará em ativação de receptor acoplado à proteína G.
Após a aplicação do ATP e BzATP do agonista, a citometria de fluxo de resolução de tempo captura o brometo de etídio que entra nas células através de poros transmembranos em tempo real. Este efeito foi atenuado pelo inibidor específico P2X7. Ensaios de resposta à concentração de ATP ilustram os efeitos da concentração agonista na formação de poros P2X7 usando mudança na fluorescência de brometo de ethidium ao longo do tempo.
Aqui, a fagocitose envolvida pelo receptor P2X7 por células progenitoras neurais hipocampais e subventriculares é exibida em tempo real. Os níveis de fagocitose nãoibidos das contas de látex YG foram estabelecidos como o controle positivo. A ATP inibiu a fagocitose das contas YG na mesma medida que os inibidores não específicos, ou seja, a fixação de paraformaldeído e o inibidor de polimerização de actinas D.5%soro aboliu toda a fagocitose inata.
Manter uma população celular saudável e reduzir o tempo no gelo é vital para obter resultados reprodutíveis. A variabilidade pode ser minimizada usando o mesmo lote de ATP para todo o ensaio celular. Nosso resultado cronometrado da citometria de fluxo demonstrado aqui é a única mensagem que pode continuar selecionando quantidades para fluxos e alterações em uma subsu população direcionada.
O método alternativo é um microscópio fluorescente e um leitor de pratos fluorescentes. No entanto, este método não pode medir continuamente as alterações fluorescentes por causa do programa de afinidade fluorescente. P2X7 é exclusivamente multimodal.
Descobrir sua expressão em uma célula de interesse abre uma série de perguntas únicas para os investigadores explorarem.
