FPOP em células juntamente com espectrometria de massa é uma nova técnica poderosa usada para estudar interações proteicas proteicas e mudanças estruturais proteicas em células vivas. Com fpop in-cell, você não precisa isolar proteínas de interesse, mas pode sim estudá-las em seus ambientes nativos. Isso é particularmente útil para proteínas de membrana.
Com este método, você pode estudar mudanças na estrutura e interações proteicas em uma variedade de doenças, incluindo câncer e distúrbios genéticos, para que você possa entendê-las e caracterizá-las melhor. Para iniciar a montagem do sistema de fluxo, use uma pedra de decote para cortar a tubulação de sílica fundida para os tamanhos apropriados. Em seguida, coloque seis pequenos ímãs cilíndricos em uma seringa de 500 microliter e encha a seringa, uma segunda seringa microliter de 500 microliter, e duas seringas de cinco mililitros com tampão de bainha.
Depois de remover o ar, coloque as seringas na bomba de seringa e aperte a rolha da bomba de seringa para que a seringa celular tenha cerca de 50 microliters deixados quando o motor parar. Usando um adaptador de isca, conecte uma válvula manual a cada seringa e monte a tubulação de sílica como ilustrado, certificando-se de roscar a célula mais a linha de sílica de peróxido de hidrogênio através da cruz e inseri-la diretamente na linha de sílica de 450 80 d'C.. Quando toda a tubulação estiver conectada, posicione o sistema de fluxo ao lado de um laser e use um isqueiro para queimar o revestimento de sílica na tubulação de diâmetro interno de 450 micrômetros para fazer uma janela para irradiação a laser.
Coloque um agitador magnético acima da seringa celular contendo os seis ímãs e coloque a bomba de seringa em 492,4 microliters por minuto para uma taxa de fluxo final de 1083,3 microliters por minuto. Escove o buffer através do sistema três vezes para lavar o sistema, verificando cada conexão para obter quaisquer vazamentos. Use uma lente convexa para focar o laser excimer na tubulação de sílica.
Para testar a janela de irradiação, coloque um pequeno pedaço de papel atrás da tubulação de sílica e ligue o laser. Em seguida, meça a região queimada da irradiação e use a janela de irradiação e a taxa de fluxo para calcular a frequência laser necessária para obter uma fração de exclusão de zero. Para coletar as células para o procedimento, lave as células de uma cultura de frasco T175 70% a 90% confluente com uma solução de sal de grau de cultura celular adequada.
Resuspense as células em 10 mililitros de tampão para contagem e coletar as células por centrifugação. É fundamental contar as células para garantir que elas sejam suficientes para análise a jusante, mas não muitas para fazê-las agregar e entupir o sistema de fluxo. Em seguida, resuspenque as células em duas vezes 10 a sexta células por mililitro de concentração de tampão de baia e aliquotar as células em um volume de 500 microliter por amostra.
Para o FPOP in-cell, encha as duas seringas de cinco mililitros com tampão de baia fresco, a seringa de 500 microliter contendo os ímãs com uma alíquota de células, e a última seringa de 500 microliter com peróxido de hidrogênio de 200 mililitros recém-preparado. Ligue o agitador magnético e aumente em 220 microliters de sulfóxido de dimetil a uma alíquota de Quench. Após uma mistura suave, coloque a Saciar atrás do sistema de fluxo para coletar as amostras irradiadas e ligar o laser.
Depois de sete segundos, ligue o sistema de fluxo. Uma vez que a amostra termine fluindo, desligue o laser e misture suavemente a saciar com a amostra coletada. Em seguida, encha todas as quatro seringas com tampão fresco e lave o buffer através do sistema de fluxo.
Após o sistema terminar a lavagem, repita o procedimento com uma nova alíquota de células e soluções sem irradiação como o controle sem laser para explicar a oxidação de fundo dentro das células. Enquanto a próxima amostra está em execução, centrifugar a primeira amostra e resuspensar a pelota em 100 microliters de um tampão de lise celular apropriado. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga para congelamento de flash em nitrogênio líquido.
Quando todas as amostras terminarem de funcionar, desmonte o sistema de fluxo e descarte o tubo de sílica usado. Em seguida, limpe todas as outras conexões por sônica por uma hora em uma solução de 50% de água 50% de metanol. Depois de isolar e digerir as proteínas do lisecelular de acordo com os protocolos padrão, analise o lysato celular digerido de acordo com os protocolos padrão tandem LCMS para localizar a modificação do FPOP em todo o prótium.
Em seguida, carregue os dados em um programa de software de análise de proteínas apropriado e analise os dados em um banco de dados de proteínas relevante e na enzima de digestão relevante. Uma vez que os arquivos são concluídos a pesquisa, calcule a extensão da oxidação FPOP na proteína de interesse. Imagens de fluorescência de imagens empilhadas ortogonal YZ mostram uma clara separação do tampão da bainha da solução celular à medida que ele flui através da janela de irradiação a laser.
Mapas de calor médios tridimensionais da solução de tampão de baia ou célula podem ser gerados para ilustrar a mistura mínima das duas soluções. O uso do sistema de fluxo celular único aumenta o número de proteínas oxidativamente modificadas em 13 vezes. Para confirmar a modificação das proteínas de interesse dentro das células intactas, a imagem de fluorescência pode ser realizada após o tratamento e irradiação de peróxido de hidrogênio.
Usando espectrometria de massa tandem, essas modificações podem ser localizadas ainda para aminoácidos específicos em uma proteína. A mudança observada neste cromatógrafo de íons extraídos traduz-se na mudança da hidroofobidade causada pela metitina oxidada no peptídeo modificado. Comparar actina rotulada em células por pegada in vitro revela níveis semelhantes de oxidação, indicando que a actina tem uma acessibilidade solvente semelhante para estudos in-cell e in vitro.
Além disso, a comparação da extensão da rápida oxidação fotoquímica da proteína das modificações de juros à acessibilidade do solvente, os resíduos rotulados calculados a partir de duas estruturas cristalinas actinas demonstram que a oxidação fotoquímica rápida em células da proteína de interesse sonda eficientemente a acessibilidade solvente da proteína monómica. Existem várias etapas adicionais que se pode tomar para aumentar a detecção das modificações mais abundantes do FPOP, incluindo cromatografia 2D, fracionamento subcelular e técnicas de multiplexação de proteômica. Com o uso de FPOP in-cell, agora podemos realizar biologia proteomiomyostructural para conectar melhor estruturas proteicas com a função celular.
Devido aos 248 comprimentos de onda de nanômetros necessários para o FPOP, certifique-se de usar sempre óculos de proteção UV e roupas adequadas para evitar exposição não intencional à radiação refletida ou dispersa.
