Este protocolo permite que os pesquisadores analisem bactérias cultivadas em condições que imitam mais de perto as encontradas em um hospedeiro mamífero, que são metálicas limitadas através de um processo chamado imunidade nutricional. Este protocolo facilita a geração de crescimento bacteriano reprodutível consistente em condições restritas metálicas e pode ser adaptado para o crescimento de muitos tipos diferentes de bactérias. Dois dias antes de iniciar o experimento, a gonococcide de talão dos estoques congeladores para placas médias gc para uma incubação não mais do que 24 horas a 37 graus Celsius.
14 a 16 horas antes do experimento de crescimento, bife colônias únicas em placas médias GC frescas. No dia do experimento, adicione de cinco a 10 mililitros de MDL a um frasco de braço lateral de 125 mililitros lavado a ácido e use este meio para apagar um colorímetro Klett. Use um cotonete de algodão estéril para inocular 20 unidades Klett de MDL de colônias solteiras saudáveis.
A geração de um saudável Neisseria gonorrhoeae inoculum para subcultura nas 96 placas de poço para ensaios de crescimento líquido é fundamental para o sucesso de todos os experimentos a jusante. Incubar as culturas a 37 graus Celsius em 250 revoluções por minuto por uma a duas horas até aproximar uma massa única duplicando antes de diluir as culturas com um volume suficiente de MDL para atingir metade da densidade cultural inicial. Então, devolva a cultura à incubadora de agitação.
Para preparar proteínas carregadas de metal, adicione a solução de phoração a uma solução de transferência humana de 10 mililitos por mililitro para alcançar a saturação de 30% do ferro. Adicione o metal de interesse à solução proteica a uma proporção molar de 15% para obter uma saturação de 25%. Use uma seringa para adicionar a proteína carregada de metal a um de diálise e diálise contra dois litros de tampão de diálise por quatro horas em temperatura ambiente.
Em seguida, mova o para dois litros de tampão de diálise Celsius de quatro graus Celsius e diálise durante a noite a quatro graus Celsius para remover quaisquer metais sem entrada. Durante a duplicação em massa, diluir ligeiramente 10X pré-misturas de interesse com PBS. Pré-trate os poços de uma microplacão de 96 poços com 15 microliters dos pré-mixes diluídos e adicione 10 microliters de 10X pré-mix e 90 microliters de MDL a cada um dos três poços para os controles em branco.
Uma vez que as culturas no frasco de braço lateral tenham dobrado, adicione 100 microliters de cada cultura a um poço nãousado na microplaca e meça a densidade óptica em 600 nanômetros. Depois de calcular a quantidade correta de diluição necessária para levar as culturas a uma densidade óptica a 600 nanômetros de 0,02, diluir as culturas com MDL em pequenos tubos de cultura e adicionar um volume suficiente para diluir os pré-mixes de 10X para 1X na placa. Em seguida, coloque a placa em um leitor de placas por oito a 12 horas com agitação para obter densidade óptica em 600 nanômetros leituras nos intervalos experimentais desejados.
Após a duplicação em massa da incubação, volte a diluir as culturas com três volumes de MDL e adicionar os tratamentos metálicos de interesse. Em seguida, incubar as culturas a 37 graus Celsius com agitação por quatro horas. Pouco antes da marca de quatro horas, corte três pedaços de papel filtro e um pedaço de nitrocelulose ao tamanho aproximado necessário para caber em um aparelho de mancha de ponto.
Pré-mergulhe o nitrocelulose em água desionizada por cerca de 10 minutos antes de montar o aparelho com papel filtro abaixo da nitrocelulose. No final da incubação, registo as densidades celulares e padronizar as densidades a uma densidade final apropriada. Então, pipeta as culturas celulares sobre a nitrocelulose.
Quando o papel filtro tiver absorvido todo o líquido desmonte o aparelho e deixe a mancha secar. Bloqueie a membrana de nitrocelulose por uma hora com uma solução de bloqueio apropriada e remonte o aparelho de mancha de ponto, substituindo o papel filtro por filme de parafina para criar um selo à prova de vazamento sob a nitrocelulose. Diluir o ligante de ligação metálica de interesse para 0,2 micromolar no bloqueador e sondar as células por uma hora com agitação moderada.
No final da incubação, sifão fora do líquido com um vácuo, lave a mancha e siga procedimentos imunológicos padrão para desenvolver o sinal. A análise ocidental da mancha da produção de proteínas em concentrações variáveis de metais revela a regulação da membrana externa responsiva de zinco tdfJ em resposta à quelação de zinco por TPEN. TdfJ é essencialmente indetectável quando o zinco é adicionado de volta ao meio.
N.gonorreia cresce na presença de calprotectina carregada de zinco, o que requer a ação do tdfH responsivo de zinco. Quando nenhuma fonte de zinco utilizável está disponível, o crescimento é restrito. Resultados semelhantes são observados na presença do zinco S100 A7, que pode servir como uma única fonte de zinco quando o transportador de membrana externa, tdfJ, é produzido.
Gonococcide cultivado em MDL são capazes de ligar calprotectina na produção de TDF E como resultado da escassez de zinco. O aumento da ligação da transferrina também é observado em culturas cultivadas no MDL, indicativo de níveis mais elevados de expressão proteica devido à natureza mais esgotada de ferro do MDL em comparação com o caldo GC quelaado. Este protocolo foi otimizado para uso com as fontes de água descritas e serão necessárias titulações adicionais com outros queladores ou metais se outros tipos de água forem usados.
Para análise adicional, pode-se realizar ensaios quantitativos de absorção de metais ou RTPCR quantitativo para estudos de expressão genética em condições de esgotamento metálico ou metal repleto.
