A organização espacial das células imunes no microambiente tumoral tem valor clínico. Essa estratégia pode ser facilmente usada para visualizar, quantificar e mapear células imunes dentro do tecido tumoral. A imunoterapia revolucionou o tratamento do câncer.
No entanto, nem todos os pacientes respondem bem. Essa estratégia pode servir para definir as assinaturas imunes teciduais que podem prever uma boa resposta anti-tumor. Antes de realizar um experimento, teste as combinações de anticorpos e técnicas de descascamento em tecidos de controle e verifique se os APPs são precisos na detecção de marcadores de interesse.
Como descrições escritas de métodos de análise de imagem usam linguagem técnica sofisticada, combinar texto com vídeo facilita uma melhor compreensão e replicação da metodologia. Para a recuperação de antígenos de seções de tecido tumoral fixas em parafina, mergulhe a amostra de tecido desatado em um frasco de Coplin de solução de recuperação de antígeno e coloque o frasco em uma panela de pressão elétrica contendo água da torneira. O nível da água não deve exceder metade da altura do frasco para que a água não se misture com a solução de recuperação de antígeno.
Feche a tampa e a válvula de pressão na panela e trate os slides com alta pressão por 10 minutos. No final do tratamento, desligue a panela, solte a pressão e abra a tampa. Depois que os slides tiverem esfriado na panela por 30 minutos, lave as amostras duas vezes por cinco minutos em PBS fresco por lavagem em um novo frasco de Coplin e use uma caneta hidrofóbica para desenhar uma barreira em torno de cada seção de tecido.
Em seguida, mergulhe os slides em 0,1-molar glycine em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente antes de enxaguar os slides duas vezes em PBS, como demonstrado. Após a segunda lavagem, transfira os slides para uma câmara de umidade e cubra cada seção de tecido com solução de bloqueio. Após 30 minutos em temperatura ambiente, enxágue as seções duas vezes por cinco minutos em PBS-Tween fresco por lavagem e adicione os anticorpos primários de interesse, diluídos na solução de bloqueio, a cada slide, protegidos da luz.
No final da incubação, enxágüe os slides três vezes em PBS-Tween fresco por cinco minutos por lavagem e, em seguida, rotule as seções com os anticorpos secundários apropriados por uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, enxágue os slides três vezes em PBS-Tween fresco por cinco minutos por lavagem. Siga com uma única lavagem em água duplamente destilada.
Remova o excesso de água de cada lâmina e monte os tecidos com meio de montagem complementado com DAPI e uma lâmina de cobertura. Depois de espremer o meio de montagem em excesso, deixe os slides secarem por 20 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz, antes de adquirir imagens para todos os canais usando um scanner de slides inteiro. Após a varredura, abra as imagens no software de análise de imagens e clique na guia Tissuealign.
Para importar as imagens a serem alinhadas na bandeja de slides, selecione a primeira imagem a ser alinhada do banco de dados. Quando todas as imagens tiverem sido carregadas, clique em Seguir nas etapas do Fluxo de Trabalho para vincular as imagens e arrastar e soltar todas as imagens a serem alinhadas à primeira imagem. Quando todas as imagens tiverem sido vinculadas conforme apropriado, use um mínimo de três pinos por imagem indicando características de tecido homólogo nas imagens vinculadas.
Use um pino para rastrear a primeira imagem para verificar a qualidade do alinhamento resultante. Se um alinhamento satisfatório tiver sido obtido, clique em "Ao lado" para visualizar as camadas de imagem e salvar a imagem composta no banco de dados. Para realizar uma detecção de tecido usando o protocolo definido pelo usuário APP 1, abra a guia Análise de Imagens e abra a imagem composta no módulo de análise de imagens.
Clique no ícone App Aberto e sele o APP apropriado. Para confirmar se o APP está funcionando, navegue até um local de tecido selecionado e clique em Visualizar. Se os resultados forem satisfatórios, clique para processar a imagem usando o APP selecionado.
Durante o processamento, o APP determinará se o pixel está ou não associado ao tecido para permitir a conversão de todos os pixels associados ao tecido em uma região de interesse. A região de interesse recém-criada pode então ser transferida para qualquer uma das imagens alinhadas. No final da análise, clique em Arquivo e Salvar para salvar a imagem modificada com a região de interesse recém-criada.
Para segmentação do tecido em stroma e parenchyma, abra a guia Análise de Imagens e selecione os arquivos de interesse do banco de dados. Open APP 2, APP 2 usa a imagem manchada de PSR para segmentação de tecidos. Visualize o APP 2 processando a imagem em um campo de exibição selecionado.
Se os resultados forem satisfatórios, clique em Executar para processar o APP 2 na imagem completa. A região de interesse do tecido será segmentada em stroma e parenchyma e suas respectivas áreas determinadas. As regiões recém-criadas de interesse para o estroma e parenchyma podem ser transferidas para as imagens alinhadas, depois exportar e salvar a imagem modificada como demonstrado.
Para identificar e quantificar populações celulares de interesse, importe a imagem segmentada de interesse no módulo de análise de imagens. Depois de ajustar a cor, abra o APP 3. O APP 3 detectará as populações celulares de interesse e as quantificará dentro do parenchyma e do estroma.
Se os resultados forem satisfatórios, execute o APP 3 na imagem completa. Todas as células individuais de interesse serão rotuladas, suas coordenadas teciduais armazenadas, e as densidades das células de interesse nas regiões estroma e parenchymal determinadas. A imagem modificada pode então ser salva como demonstrado.
Para realizar o aquecimento dos objetos rotulados por célula de interesse, abra o protocolo definido pelo usuário apropriado na janela de seleção do APP e clique em Executar para solicitar que o APP use as coordenadas dos objetos rotulados por anticorpos para gerar o mapa de calor. As áreas de hot spot, destacadas em vermelho, contêm a maior densidade da população celular de interesse, enquanto as áreas azuis escuras têm as mais baixas. O mapa de calor de uma população celular específica pode ser sobreposto às imagens alinhadas para fornecer informações adicionais sobre como essas células são organizadas dentro do microambiente tumoral.
Em seguida, exporte e salve o mapa de calor do tecido. É fundamental verificar a especificidade da rotulagem, a precisão dos APPs projetados e a eficiência de descascamento e rerobagem das diferentes manchas na mesma seção. Ao integrar imagens seriais, rotulagem sequencial e alinhamento tecidual, mais marcadores podem ser visualizados simultaneamente e mais informações podem ser extraídas de amostras clínicas limitadas.
A coloração de H&E de seções de tecido tumoral ressecado permite a avaliação da arquitetura tecidual, morfologia celular e parâmetros clinicamente relevantes, como o tipo de malignidade, grau tumoral e infiltração imune geral. A coloração cd34 permite a detecção de células endoteliais. A coloração de cytokeratin 8/18 revela a presença de células epiteliais, e a coloração da actina muscular suave anti-alfa permite a identificação de células estelares fibrogênicas, ativadas e hepáticas.
Reprobing com anticorpos contra CD68 e Desmin permitem a detecção de macrófagos e miofibroblasts, respectivamente. Para caracterizar melhor o tumor-imunológico infiltrado, a coloração para marcadores de células T e mieloperoxidase pode ser realizada. Picro Sirius A coloração vermelha também pode ser realizada para visualizar colágeno fibrilar e facilitar a segmentação de estroma e parenchyma.
Pixels associados a tecidos dentro das seções manchadas podem ser identificados para permitir a segmentação de diferentes compartimentos dentro de uma região específica de interesse. As populações celulares de interesse podem então ser identificadas dentro de cada região, permitindo a geração de mapas teciduais para quais regiões de alta densidade para uma determinada população celular são exibidas como pontos quentes e regiões com densidade relativamente baixa aparecem como pontos frios. Essa metodologia de identificação, quantificação e mapeamento de células imunes em amostras de tecido pode ser adaptada e validada para questões específicas de pesquisa e marcador de interesse.
Essa estratégia pode ser aplicada a micro matrizes teciduais para análise de alto rendimento. Também pode ser combinado com hibridização in situ para examinar simultaneamente em proteína situ e expressão genética. Usamos essa estratégia para identificar e mapear células produtoras de IL-17A in situ in fibrotic liver tissue de pacientes.
Conforme indicado no protocolo, vários reagentes são quimicamente perigosos e os procedimentos pertinentes devem ser realizados em uma coifa química utilizando o equipamento de proteção pessoal adequado e precauções.
