Mostramos que genomas virais do grupo IV codificam pequenos trechos de sequências proteicas hospedeiras. Essas sequências podem ser encontradas nos locais de decote protease viral. Eles estão sendo usados para a destruição direcionada de proteínas hospedeiras, tipicamente proteínas envolvidas na geração das respostas imunes.
Uma grande vantagem do uso de ensaios protease é que ele remove a complexidade de uma célula e mostra se uma protease viral pode ou não cortar uma sequência específica. Assim, quando analisamos as sequências de Zika SSHHPS, descobrimos que a protease poderia cortar sequências em proteínas envolvidas na geração de respostas imunes e que algumas dessas proteínas também tinham papéis no desenvolvimento cerebral e ocular. Ao realizar essa técnica pela primeira vez, deve-se lembrar que se o decote não for observado, que pode ser devido a uma variedade de fatores, como a atividade da protease.
Demonstrando o procedimento será Jaimee Compton, uma técnica do meu laboratório. Comece abrindo protein BLAST e coloque os 20 aminoácidos ao redor da ligação scissile e a poliproteína viral e selecione sequências proteicas não redundantes, em seguida, digite no genoma hospedeiro para ser pesquisado. Se necessário, selecione PHI-BLAST e digite uma sequência de padrão onde os suportes quadrados indicam que qualquer aminoácido dentro dos suportes pode estar na posição de substituição e, em seguida, acerte BLAST.
Classificar a ordem dos hits BLAST com base no número de resíduos idênticos ou tolerados consecutivos que correspondem a uma sequência de local de decote. Na lista, selecione as proteínas contendo seis ou mais resíduos idênticos ou similares para análise nos ensaios protease. Construa um plasmídeo codificando a proteína fluorescente ciano, até 25 aminoácidos da sequência de decotes, e a proteína fluorescente amarela.
Em seguida, prepare os substratos CFP e YFP inoculando quatro frascos de quatro litros com 25 mililitros de uma cultura durante a noite. Agite as culturas a 37 graus Celsius e monitore o crescimento de hora em hora pela espectroscopia UV-Vis a 600 nanômetros. Quando as bactérias atingem uma absorção de cerca de um, induza a expressão proteica adicionando 0,5 mililitros de um IPTG molar a cada frasco, em seguida, reduza a temperatura da incubadora de agitação para 17 graus Celsius e permita que a expressão continue durante a noite por 17 a 20 horas.
No dia seguinte, pelota as bactérias por centrifugação a 7000 vezes g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Remova e descarte a mídia líquida e, em seguida, armazene as pelotas a menos 80 graus Celsius ou prossiga com a lise celular. Para lise as células, prepare 100 mililitros de tampão de lise de acordo com as instruções do manuscrito, resuspenque as pelotas no buffer e transfira de 25 a 25 mililitros da suspensão para tubos cônicos descartáveis de 50 mililitros.
Coloque os tubos em um béquer plástico com água gelada e insira a ponta do sonicador no tubo de modo que a ponta esteja a cerca de um centímetro da parte inferior do tubo e sonicar o lisato 10 a 20 vezes até que ele se torne fluido e liquefeito. Após a sônicação, transfira o lise para tubos de centrífugas de alta velocidade e centrifuá-lo a 20,500 x g por 30 minutos a 4 graus Celsius. Transfira o supernatante para uma garrafa limpa e descarte as pelotas.
Carregue o lise na coluna de níquel e lave a coluna com dois volumes de coluna de tampão A seguidos por cinco volumes de coluna de 20% tampão B.A absorção a 280 nanômetros aumentará durante a lavagem como contaminantes elute da coluna. Continue lavando até que o A280 retorne aos valores básicos. Em seguida, elute a proteína com dois a três volumes de coluna de 100% tampão B e coletar frações de 10 mililitros, certificando-se de medir o A280 de cada fração.
Prepare oito misturas de reações de acordo com as instruções do manuscrito e pipetas 45 microliters de cada mistura nos três primeiros poços de cada linha de uma placa preta de meia-área de 96 poços. Configure o leitor de placas para detecção simultânea de florescência em dois comprimentos de onda com uma configuração fixa do tubo fotomultiplier. Programe o tempo de leitura para 20 a 30 minutos com uma leitura por minuto e selecione os poços a serem lidos.
Insira a placa na máquina e inicie a leitura, monitorando as relações de emissão ao longo do tempo. Execute uma leitura final da placa contendo o substrato sem cortes. Remova a placa e a pipeta cinco microliters de enzima em cada poço.
Pode-se salvar a primeira coluna como um controle sem cortes. Em seguida, leia novamente a placa por 20 a 30 minutos, certificando-se de definir o leitor de placas para produzir valores absolutos. Uma vez que a leitura esteja completa, sele a placa com filme para evitar a evaporação e deixe-a durante a noite à temperatura ambiente para permitir que a enzima corte completamente o substrato.
Após 24 horas, remova o filme e realize uma leitura final da placa. Média das taxas de emissão e registo-los como corte. Confirme o decote do substrato usando SDS-PAGE.
Carregue um marcador de peso molecular na primeira ou última pista e carregue cinco microliters de cada mistura de reação em uma faixa do gel, começando com a reação sem cortes. Conecte os eletrodos do tanque de gel à fonte de alimentação e execute os produtos a 110 volts por 60 minutos. Remova o gel do usando uma ferramenta de rachaduras e submerse-o em cinco a dez mililitros de solução de coloração.
Após uma a 24 horas, remova o excesso de mancha e submerse o gel na água. Em seguida, tire uma foto do gel usando um imager de gel. Para preparar a estrutura proteica, carregue o arquivo PDB proteico em MOE.
Clique em Selecionar e Solvente e, em seguida, exclua o solvente. Abra o painel Depreparação de estrutura da barra de menu superior compute e corrija automaticamente todos os itens estruturais clicando em Corrigir. Protonar a estrutura clicando em Protonato 3D.
Adicione cargas parciais à proteína abrindo o painel Cargas Parciais e selecionando AMBER 99 e Ajuste os hidrogênios e pares solitários conforme necessário. Em seguida, salve o arquivo da estrutura. Para construir a estrutura para os peptídeos do substrato e TRIM14, abra o painel Protein Builder, digite a sequência do substrato e selecione Auto Repack.
Em seguida, defina Geometria como Estendida e clique em Construir. Por fim, minimize a estrutura e salve-a como um arquivo PDB. Docas os peptídeos substratos para VEEV-nsP2 usando o software PyRx AudoDock 4.2.
Carregue a proteína, clique com o botão direito do mouse no nome e selecione Fazer Macromolécula para preparar o arquivo de encaixe PDBQT. Em seguida, carregue a molécula do substrato e selecione Fazer Ligand para preparar o arquivo de acoplamento de ligantes. Inicie o assistente AutoDock no painel de acoplamento na parte inferior e selecione os arquivos de ligantes e proteínas preparados.
Defina o bolso de ligação de proteína ajustando manualmente a dimensão da grade e execute AuotGrid. Em seguida, execute o AutoDock e selecione o método do algoritmo genético lamarckiano. Clique em Docking Parameters e defina o número de execuções de GA para 50 e clique em Avançar para iniciar a execução de acoplamento.
Quando o AutoDock estiver completo, abra o painel Analisar resultados e inspecione todas as poses de vinculação previstas. Selecione o melhor modelo com a menor energia de ligação prevista e interações de ligação razoáveis entre o cis-477 e o substrato no site de decote e, em seguida, salve-o como um arquivo PDB para novas simulações de MD. Após a leitura das poses de vinculação com AutoDock, é importante realizar análises pós-acoplamento para identificar o modelo de ligação plausível para refinamento com simulações de MD.
Este protocolo foi usado para encontrar pequenos trechos de sequências de proteína hogênicas hospúricas ou SSHHPS no vírus Zika ns2B/3 protease. Foram identificados quatro alvos de proteína hospedeira. FOXGS, SFRP1, uma subunidade Gsalpha de uma biblioteca de cDNA de retina, e o mitocondrial NT5M 5'3'nucleotidase.
Os alinhamentos sequenciais do SSHHPS permitiram diferenças específicas das espécies nas sequências do local do decote. A sequência SFRP1 foi idêntica em humanos e galinhas, o que é notável porque o vírus Zika pode induzir mortalidade e microcefalia em embriões de frango. O ensaio contínuo foi utilizado para medir parâmetros cinéticos de estado estável e constantes de inibição para as sequências de poliproteína viral e o ensaio descontínuo foi utilizado para obter informações qualitativas de decote, como o decote de uma determinada sequência ou a inibição da protease por vários compostos.
Um modelo da junção de encefalite equina venezuelana nsP1-nsP2 foi feito utilizando-se em métodos de silico. Para o protease nsP2, alongar a sequência do substrato e reduzir a força iônica do buffer levou a uma redução significativa na constante michaelis de decote de uma sequência de vírus da Floresta Semliki. Ao tentar este procedimento, é importante executar os controles.
Substratos contendo as sequências virais do local do decote protease devem ser testados antes de prosseguir com a análise da sequência SSHHPS. Se o decote de uma proteína hospedeira for observado, devem ser realizados experimentos de acompanhamento para confirmar que essa proteína hospedeira afeta a replicação viral. Isso pode ser feito superexpressando ou silenciando a proteína e, em seguida, examinando os efeitos na replicação viral.
O grupo IV contém um grande número de patógenos novos e emergentes. As sequências SSHHPS conectam proteínas específicas do hospedeiro e caminhos com as proteases virais de forma muito previsível.
