O endométrio é um tecido que muda todos os meses em resposta aos hormônios. O desequilíbrio hormonal pode prevenir o apego de embriões e também causar doenças como o câncer. Nosso protocolo reconstrói o endométrio para que possa ser estudado fora do corpo da mulher de forma fisiológica.
A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma estrutura 3D de células compostas por dois tipos de células hormonicamente responsivas, as células epiteliais e estroma que se organizam e se comportam especificamente como no corpo. Uma vez que os organoides podem imitar melhor o comportamento do tecido, eles podem eventualmente ser usados para testar diferentes drogas. Os organoides endometrial podem ser usados para estudar efeitos diretos de fatores de risco atualmente conhecidos para o câncer, incluindo obesidade e síndrome do ovário policístico.
Nossos organoides enfatizam a importância das ações paracrínas entre dois tipos de células. É importante começar com uma quantidade adequada de tecido. Obter a densidade certa de células epiteliais e estromais pode ser complicado.
Além disso, os organoides são bastante pequenos e podem ser difíceis de visualizar com a coloração do IHC. A visualização desse procedimento é importante porque existem algumas etapas que serão muito mais fáceis de entender depois de vê-las. Estes incluem obter a camada tecidual certa do útero, obter a densidade certa das células para combinar, e semear os moldes de agarose.
Antes de iniciar o isolamento celular, funde e equilibre micro moldes de 1,5% agarose de acordo com as instruções do fabricante para abrigar os organoides. Em um armário de biossegurança, use técnicas assépticas para preparar uma solução enzimática a 37 graus Celsius e filtrar a solução usando um filtro de seringa de 0,2 micrômetros em um tubo cônico de 15 milímetros. Usando um bisturi, raspe o endométrio das biópsias uterinas e pique o tecido em pedaços muito pequenos.
Coloque o tecido recém-picado no tubo cônico de 15 mililitros contendo a solução enzimática. Feche a tampa e enrole a parte superior do tubo com uma filme de cera para evitar contaminação. Coloque o tubo em um banho de água ou incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação suave.
Depois disso, empilhe um coador de células de 100 mícrons em cima de um coador de células de 20 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros. Filtre a solução através dos dois filtros. Enxágüe o tubo cônico de 15 mililitros com HBSS e coloque esta lavagem através do coador para garantir que todas as células sejam coletadas.
Em seguida, inverta o coador de células de 20 mícrons em um novo tubo cônico de 50 mililitros e lave as células epiteliais do coador com 20 mililitros de mídia organoide suplementada com 1%penicilina e estreptomicina. Centrifugar os tubos cônicos a 500 G por cinco minutos. Para as células estromais coletadas, remova o supernasal e resuspense a pelota em 10 mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos.
Incubar a 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Centrifugar essas células a 500 G por cinco minutos. Remova o supernatante e resuspenja a pelota com 200 a 300 microliters de mídia organoide.
Para células epiteliais coletadas, remova o sobrenascer e resuspenja a pelota em 100 microliters de mídia organoide. Depois que os moldes de 1,5% de agarose forem equilibrados, remova a mídia organoide na parte externa dos moldes de agarose e incline a placa de cultura tecidual para que o meio da câmara de semeadura celular dos pratos agarose também possa ser cuidadosamente removido. Veja as suspensões epiteliais e células estrobomais sob um microscópio e adicione mais mídia organoide às suspensões, certificando-se de adicionar apenas 100 microlitros por vez para que a suspensão seja aproximadamente igual em densidade.
Em seguida, combine uma parte das células estromas com três partes das células epiteliais em volume. Pipeta 50 microliters da suspensão celular combinada na câmara de semeadura celular do molde de agarose. Uma vez que os moldes de agarose são preenchidos com células, adicione cuidadosamente 400 microliters de mídia organoide fresca nos poços da placa de 24 poços.
Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, certificando-se de mudar o meio a cada dois dias com 500 microliters de mídia organoide. Após sete dias, mude o médio para um que é suplementado com estradiol nanomolar 0,1 e 0,8 testosterona nanomolar para promover a organização das células epiteliais e estromal. Primeiro, dissolver 1,5% de agarose na PBS por ebulição.
Coloque o líquido em uma béquer de água quente e deixe esfriar a aproximadamente 50 graus Celsius. Sob um microscópio dissecando, incline a placa de 24 poços e cuidadosamente pipeta para fora do molde de agarose. Em seguida, cuidadosamente pipeta para fora do meio do interior do molde de agarose para evitar perturbar os organoides.
Adicione cuidadosamente entre 70 e 75 microliters de calor, 1,5% de agarose na câmara do prato de agarose, tomando cuidado para não perturbar os organoides. Deixe a placa esfriar a quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois disso, adicione 4% de paraformaldeído em cada poço da placa de 24 poços e fixe todo o molde de agarose selado durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, armazene a placa em 70% de etanol a quatro graus Celsius até estar pronto para processar a incorporação de parafina. Para iniciar o isolamento do RNA, veja a placa sob um microscópio dissecando. Incline a placa e cuidadosamente pipeta para fora do meio da câmara do molde agarose.
Pipeta com força um mililitro de meio organoide fresco diretamente no molde de agarose para que os organoides sejam liberados dos microwells, tomando cuidado para não criar muitas bolhas. Repita este processo de pipetação forte uma vez usando o mesmo meio. Depois disso, colete todos os meios que contenham os organoides.
Centrífuga a 500 G para coletar os organoides, e proceder à extração de RNA. Neste estudo, organoides endometrial humanos compostos por células epiteliais e estromais do endométrio são gerados sem o uso de materiais exógenos de andaimes. Para o processamento histológico, os moldes de agarose contendo os organoides endometrial são selados com agarose, seguidos de fixação com 4% de paraformaldeído durante a noite.
Estes moldes são processados para incorporação padrão de parafina seccionada e manchada para histologia, imunfluorescência ou imunohistoquímica. A hematoxilina na coloração de eosina revela uma estrutura semelhante a esferoides com uma única camada de células forrando o exterior e as células no centro. Marcadores específicos de células para células endometrial, epitelial e células estromais revelam células epiteliais ao redor do organoide com células estromais no centro.
Marcadores da fisiologia endometrial confirmam que os organoides endometrial mantiveram certas características do tecido nativo. A coloração tri-cromada, que mancha o azul de colágeno e as células vermelhas, mostra a presença de colágeno dentro do centro onde residiam as células estromal, demonstrando produção ativa e secreção de colágeno por células estromicas semelhantes ao tecido nativo. Além disso, a coloração imunohistoquímica revela a presença de receptores de estrogênio, receptores de andrógeno e receptores de progesterona nas células epiteliais e estrômais.
É importante emplacar as células densamente para que tenhamos organoides suficientes para experimentos a jusante. Isso vai levar algum prática. Organoides endometrial podem ser cultivados em diferentes condições e depois colhidos para experimentos como imunohistoquímica ou coloração de imunofluorescência para estudar expressão proteica ou colhidos para RNA estudar a expressão genética.
Nosso laboratório investiga como o endométrio responde aos níveis hormonais alterados, o que pode levar à hiperplasia endometrial e câncer. Podemos usar esses organoides para tratamentos de longo prazo de hormônios e adicionar condições patológicas, como o excesso de testosterona encontrada na síndrome do ovário policístico, ou sinais de adipócitos para estudar alterações endometrial induzidas pela obesidade. Os tecidos humanos são considerados biogásionos, e será importante tomar as precauções apropriadas.
