Este protocolo fornece uma maneira de avaliar o envolvimento de um determinado fator na dupla fertilização da Arabidopsis. O estado de fertilização pode ser julgado pela morfologia dos núcleos espermatozoides rapidamente, de modo que a rápida obtenção dos dados para análise estatística é possível. Este método é específico para avaliação para fenótipo de fertilização em Arabidopsis.
Ainda existem reguladores de fertilização desconhecidos, mesmo que em Arabidopsis. Este método seria útil para a análise funcional de futuros fatores de fertilização desconhecidos. Dominar a habilidade de manuseio rápido e intacto dos ovulos é importante para o sucesso desta análise.
Para começar, cresça Arabidopsis thaliana a 22 graus Celsius sob uma luz de 16 horas e ciclo escuro de oito horas em uma câmara de crescimento. Corte e remova o primeiro talo de flores desenvolvido com tesoura para promover o desenvolvimento de botões axilares. Duas a três semanas depois de cortar o primeiro talo, meça a altura da planta.
Plantas com altura acima de 25 centímetros são consideradas plantas de crescimento vigoroso e são adequadas para análise. Para emascular, procure por botões na fase 11 com pedaços de pétalas vistos no topo. Use um número cinco fórceps para remover sepala, pétala e estase de botões de flores.
15 a 18 horas após a emasculação, tome o stamen de uma linha DMP9-knockdown com fundo de flor HTR10-mRFP no estágio 13, beliscando o filamento com fórceps. Para polinizar, gentilmente acariciar o estigma de um pistil emasculado várias vezes com um anther dehiscente. Sete a oito horas após a polinização, pegue o pistil e coloque-o na fita de dois lados.
Em seguida, pressione suavemente com fórceps para fixar o pistil na fita. Sob um microscópio dissecando, corte as extremidades superior e inferior do ovário usando uma agulha de injeção. Mova a ponta da agulha de injeção para cortar a parede do ovário ao longo de ambos os lados do replum.
Corte cuidadosamente para não separar o funículo e o trato transmissor. Everta a parede do ovário. Aperte a base do septo ao qual os ovulos estão conectados, e levante-o cuidadosamente com fórceps.
Transfira os ovulos em uma gota de água em um copo de toboágua, e cubra delicadamente com um copo de cobertura para observação sob um microscópio de fluorescência. Em um microscópio de epifluorescência equipado com um cubo de filtro de fluorescência, ajuste a lente objetiva para 20x ou 40x. Adquira imagens dos ovulos contendo núcleos de esperma rotulados com mRFP.
Confirme o número de núcleos de esperma rotulados com mRFP em um saco de embriões. Confirme a forma e a posição de cada núcleo de esperma rotulado por mRFP em um saco de embriões. Neste estudo, os fenótipos de fertilização foram julgados pela morfologia do sinal nuclear do esperma em ovule.
A maioria dos ovulos continha dois núcleos de esperma rotulados com mRFP no lado micropirlar da célula óvula e lado final charazal de células centrais. Isso indica fertilização dupla bem sucedida. Além disso, foram observados ovulos contendo um núcleo de esperma rotulado por mRFP no núcleo celular central, além de um núcleo de espermatozoides condensado rotulado por FPM fora da célula ólda, indicando uma única fertilização.
No caso da fertilização dupla fracassada, dois núcleos de espermatozoides condensados rotulados por FPM foram observados no limite da célula óvulo e da célula central. Na análise utilizando a linha DMP9-knockdown com fundo de pólen HTR10-mRFP, os ovules contendo um único núcleo condensado de esperma rotulado mRFP ou três ou mais núcleos de esperma rotulados com mRFP raramente foram observados. Combinando com o uso de linhas de marcadores femininas, pode-se analisar um estado de fertilização mais preciso.
Por exemplo, o status de fertilização após a fusão do gamete e antes da karyogamia pode ser julgado. Sim, o processo de fertilização é dividido em várias etapas. As perguntas que cada regulador de fertilização envolvido em quais etapas podem ser respondidas com este método aprimorado.
Forneceria uma visão mais profunda sobre a reprodução sexual da planta.
