Este protocolo pode ajudar o cientista interessado em microscopia não linear a entender os componentes-chave, a configuração e o procedimento de alinhamento de um microscópio baseado na dispersão estimulada de Raman. As principais vantagens da microscopia SRS são suas habilidades para realizar imagens sem rótulos baseadas no contraste vibracional e adquirir uma imagem em poucos segundos. A microscopia SRS levou a imagem livre de rótulos a novos patamares, especialmente estudos de estruturas biológicas complexas, como lipídios, que são fundamentais para as células e a arquitetura celular.
O sinal SRS é detectado como uma pequena mudança na intensidade do feixe da sonda e pode ser corrompido pelo ruído. Portanto, um sinal preciso é crucial. Para começar, alinhe o OPO e os raios laser de safira de titânio para que ambos cheguem ao microscópio.
Em seguida, coloque os detectores de posição do raio laser em duas posições entre o espelho dicroico um e o espelho seis. A primeira posição está localizada perto do espelho dicroico um e a segunda está perto do espelho seis. Para cada posição, use os sensores para detectar as coordenadas X e Y do feixe OPO.
É importante verificar se as coordenadas X e Y do raio laser de titânio-safira são do mesmo OPO em ambas as posições dos detectores do sensor. Se, em algumas posições, as coordenadas não coincidirem, sintonize a inclinação do espelho adjacente para compensar. Siga este mesmo procedimento para alinhar as posições do feixe de safira de titânio em relação ao OPO para o caminho entre os seis e sete do espelho.
Instale um espelho adicional em um suporte de flip-flop entre o espelho seis e sete e gire o suporte do espelho para direcionar o feixe para o autocorrelador. Ligue o controlador de correção automática, inicie o aplicativo de software no computador que o controla e ajuste o parafuso de ajuste de distância do feixe do autocorrelador para sua posição normal em 8,35 milímetros. Em seguida, pare o feixe de safira de titânio e solte e projete o feixe OPO do espelho adicional para o espelho de entrada do autocorrelador.
Tente ajustar o espelho de entrada para maximizar o sinal de pulso laser, como mostrado aqui. Em seguida, pare o feixe OPO e solte e projete o feixe de safira de titânio do espelho montado no flip-flop para o espelho de entrada e para o corregedor automático. Repita o ajuste ideal do feixe até que o sinal de corretivo automático, mostrado aqui, seja obtido.
Agora, ajuste o parafuso de ajuste de distância do feixe para a posição cruzada em 7,30 milímetros. Solte os dois feixes e escaneie a linha atrasada para sobrepor as duas vigas. Obtenha o sinal de correlator cruzado resultante, como mostrado aqui.
Em seguida, gire o espelho montado no flip-flop para que os feixes possam alcançar o espelho sete e a cabeça de varredura do microscópio. Remova o condensador e use o botão de fuga para retrair temporariamente a lente subjetiva de 60x. Em seguida, gire a peça do nariz para mover a lente subjetiva de 60x para fora do caminho óptico.
Em seguida, monte o detector na parte superior do microscópio usando o suporte mecânico externo. Conecte a saída do detector através de um filtro de passe baixo de 50 Ohm a um osciloscópio. Agora, ligue o processador que controla a cabeça do scanner e projete o feixe OPO na cabeça do scanner do microscópio.
Monitore o sinal OPO e maximize a energia medida pelo detector usando um tradutor XY. Em seguida, troque o feixe do laser OPO para o laser de titânio-safira e verifique se um sinal também é obtido para o laser de safira de titânio. Isso indica que ambas as vigas estão bem alinhadas.
Finalize o alinhamento do feixe girando para trás a peça do nariz para introduzir o subjetivo de 60x. Em seguida, use o botão de refoco no microscópio para recuperar o foco finalizado para a lente objetiva do microscópio 60x. Por fim, coloque o objetivo, com uma ampliação de 40x, no lugar do condensador sem tocar ou perturbar a amostra.
Defina a potência dos lasers titanium-safira e OPO medidos antes do microscópio para 30 miliwatts para ambos os feixes. Em seguida, defina o comprimento de onda do laser OPO a um valor diferente, em relação ao anterior, de modo que a bomba e a sonda não estejam em ressonância com a frequência vibracional das contas. Em seguida, solte ambos os feixes, para que entrem no microscópio.
Execute o tradutor informatizado da linha de atraso de varredura e regise a intensidade medida usando o amplificador de travamento para cada posição da linha de atraso. Aguarde até que a varredura da linha de atraso esteja completa. Agora, defina o comprimento de onda do OPO de volta para 1076 nanômetros, de modo que a bomba e a sonda estejam em ressonância com a frequência vibracional das contas.
Execute a linha de atraso de varredura do tradutor informatizado e aguarde até que a varredura da linha de atraso esteja concluída. Por fim, defina a posição de sobreposição obtida e a linha de atraso para a próxima aquisição de imagens de dispersão de Raman estimuladas. Para otimizar a sincronização espacial dos feixes, comece por parar o feixe de safira de titânio e reduzir a potência OPO para oito miliwatts.
Em seguida, conecte a leitura do detector ao cartão de aquisição de dados. Execute o programa de aquisição de dados junto com o console de digitalização de microscópio. Quando terminar, salve o arquivo e processe os dados para obter uma imagem como a mostrada aqui.
Em seguida, pare o feixe OPO e reduza a potência de titânio-safira para 2,5 a 4,5 miliwatts. Conecte o detector com o amplificador de travamento e suas leituras com o cartão de aquisição de dados. Em seguida, execute novamente o programa de aquisição de dados junto com o console de digitalização de microscópio.
Quando terminar, salve o arquivo e processe os dados para obter uma imagem como a mostrada aqui. Introduza uma pilha de filtros entre o objetivo de 40x e o fotodiodo para remover os pulsos da bomba e adquirir apenas o sinal de botão. Em seguida, defina o sinal da bomba para 810 nanômetros com uma potência focal focada de oito miliwatts.
Defina o sinal da sonda para 1076 nanômetros com a mesma potência focal focada de oito miliwatts para investigar uma ligação carbono-hidrogênio típica de poliestireno com uma mudança raman de 3054 centímetros inversos. Conecte o detector com o amplificador de travamento e a leitura do amplificador de bloqueio ao cartão de aquisição de dados. Finalmente, defina o formato de pixel e o tempo de aquisição no programa de microscópio e execute-o e ao sistema de aquisição de dados, salvando o arquivo matrix assim que ele estiver completo.
Uma medição de exemplo de um único ponto da amostra é exibida aqui. Quando o feixe não é sobreposto no tempo ou espaço, o resultado obtido é fora da ressonância, onde a amplitude do sinal, medida por um amplificador de travamento, é zero. A fase desse sinal, no entanto, salta entre valores negativos e positivos.
Se os feixes forem sobrepostos no espaço, o sinal aumenta e atinge seu máximo quando os feixes são perfeitamente sobrepostos no tempo, enquanto a fase começa a atingir um valor fixo durante o tempo em que as vigas são sobrepostas. Em uma imagem de transmissão, um único feixe é usado e a intensidade do feixe transmitido da amostra é medida por um fotodiodo. À esquerda, a imagem de transmissão foi obtida utilizando OPO, enquanto à direita, a imagem de transmissão foi obtida utilizando-se de safira de titânio.
Um exemplo típico de uma imagem SRS é mostrado aqui, no qual são relatadas imagens livres de rótulos de contas de poliestireno com diâmetros de três micrômetros. Para obter uma imagem de alta qualidade, baseada na microscopia SRS, o alinhamento de um microscópio é fundamental. Portanto, todos os passos indicados no protocolo devem ser realizados com cuidado.
