Nosso protocolo aproveita a administração local do neurotransmissor inibidor de ocorrência natural GABA usando um dispositivo muito novo, que poderia propor uma nova solução no tratamento de convulsões epilépticas. A bomba de íons microaerofílico nos permite ter um controle muito preciso sobre exatamente quando e onde estamos entregando drogas. O parto eletroforético com problemas poderia ser modificado para atingir outras doenças neurológicas.
Outro benefício desta técnica de entrega de drogas é que há um aumento de pressão muito insignificante na tomada de entrega de drogas porque não há fluido que está realmente sendo entregue. Em vez disso, são apenas as moléculas de drogas em si. Uma vez que a localização próxima das sondas será o maior problema, é muito aconselhável testar seus ângulos de alinhamento e posicionamento com sondas falsas no quadro estereotaxic.
Comece fixando a cabeça de um rato anestesiado em um quadro estereotaxico e usando uma agulha de calibre 30 para injetar um analgésico local subcutânea no local de incisão planejado. Depois de cinco minutos, use um bisturi para fazer uma incisão no crânio. E use fórceps finos para retrair suavemente a pele.
Aperte a pele com grampos de serofina bulldog. E limpe a superfície exposta do crânio da fáscia. Usando uma broca dentária com uma broca fina, redonda de 0,4 milímetros, faça um furo no crânio acima do cerebelo até que a duraza esteja visível.
Coloque o parafuso moído no orifício e use uma chave de fenda de precisão para girar o parafuso até atingir a parte superior do cerebelo. Usando o quadro estereotaxic, meça as coordenadas estereotribuíficas para a região cerebral desejada e use o conjunto de brocas a uma velocidade rápida para diminuir uma área de aproximadamente um a dois milímetros de diâmetro do crânio, sobre a região alvo, até que uma fina e bem polida membrana óssea transparente permaneça. Em seguida, use uma agulha de ponta fisada feita sob medida para remover a dura e adicionar uma gota de soro fisiológico no orifício resultante.
Para a inserção da sonda de silício multicanal, coloque a sonda no braço estereotaxista preso a um suporte magnético e coloque o braço ao lado do quadro estereotaxic. Coloque os braços estereotaxicos em um leve ângulo anterior-posterior de 20 graus para deixar amplo espaço para o posicionamento dos outros dois implantes. E conecte a sonda ao estágio da cabeça e ao parafuso de terra.
Use o braço estereotaxista preciso de micron para baixar lentamente a sonda de silício no hipocampo e iniciar o software de gravação para gravar os sinais neuronais elétricos enquanto move a sonda de silício multicanal do topo do córtex até que a posição dorsoventral alvo seja alcançada. Em seguida, regise simultaneamente o sinal potencial de campo local das camadas do córtex e do hipocampo durante a penetração na tela do computador e use a atividade de ondulação na camada piramiológica da formação hipocampal no potencial de campo local registrado como um marcador da zona alvo. Para o enchimento da bomba de íon microfluidic, conecte os tubos à entrada da bomba e encha a sonda com solução GABA molar 0,05.
Remova os tubos e feche a entrada com a embalagem do filme de parafina e certifique-se de que a bomba de íons microfluidic está presa com segurança ao suporte. Tome cuidado ao montar o suporte no braço do micromanipulador antes de conectar os fios elétricos à unidade de medição da origem. Com o braço estereotaxista em um ângulo medio-lateral de 20 graus, baixe a bomba lentamente com movimentos axiais o mais próximo possível da sonda sem deixar a bomba dobrar, até que a bomba atinja a coordenada dorsoventral de 1200 micrômetros negativos da superfície cortical.
Em preparação para a indução da convulsão, remova o cubo de agulha metálica de uma seringa de 10 microliteres e fixe uma micropipette borossilicata na ponta da seringa. Coloque o cubo sobre a ponta da micropipette e posicione a seringa em um ângulo lateral-medial de 20 graus. Use uma bomba de microinjeção automatizada para carregar de 500 a 1000 nanolitadores de 50 mililitros de aminopiridina completa em fluido cerebrospinal artificial na seringa e baixar a micropipette de vidro para a posição de coordenada dorsoventral.
Injete 250 nanoliters da solução no cérebro e inicie a gravação no software. Em seguida, observe a tela e aguarde que o primeiro pico interictal apareça antes de aplicar um volt entre a fonte e o alvo por 100 segundos e um segundo fora por 30 ciclos para entregar a solução GABA. A localização precisa dos implantes ajuda no registro dos potenciais de campo locais hipocampal, induzindo as pequenas convulsões hipocampais e fornecendo GABA no início da convulsão.
Além disso, a localização dos implantes pode ser verificada após cada experimento por histologia pós-hoc. Aqui, um exemplo de quando eventos semelhantes a convulsões poderiam ser interrompidos com a entrega do GABA pela nova sonda neuronal, incorporando a sonda microfluida é mostrado. Quando quatro aminopirdina foram injetadas em uma área maior ou no topo do córtex, as convulsões epilépticas se generalizaram, de modo que o GABA entregue não foi capaz de modificar a extensão das convulsões epilépticas.
Notavelmente, a entrega de íons de sódio não teve um efeito significativo na atividade induzida pela aminopirida. Portanto, este protocolo pode ser útil para qualquer cirurgia estereotaxica que envolva a implantação de múltiplas sondas frágeis. Com a ajuda da bomba de íons microfluido, outras espécies em moléculas carregadas poderiam ser introduzidas para tratar não apenas a epilepsia, mas outras doenças neurológicas.
A entrega eletroforética na interligação de tecidos apresenta uma nova abordagem em geral de entregar espécies em qualquer tecido mole. Tome cuidado especial ao aplicar o 4AP, já que é uma toxina e induz a epilepsia.
