Este método pode ajudar a responder a várias questões-chave envolvidas na produção de oligossacarídeos de leite humano. Primeiro, quanto do produto eu tenho? E segundo, qual é a ligação específica de carboidratos?
O objetivo aqui é simplificar e acelerar o processo de quantificação e caracterização desses oligossacarídeos de leite humano. Este método tem duas vantagens em relação ao estado atual da arte. Primeiro, é agradável para a triagem de alto rendimento.
Então, você pode imaginar testar milhares de condições diferentes ou talvez até mesmo uma biblioteca de enzimas de síntese em um dia usando essa técnica. Além disso, usa a especificidade única do substrato que a natureza evoluiu nas enzimas para nos dar informações sobre a ligação de carboidratos desses oligossacarídeos. Acreditamos que este método pode melhorar a produção de oligossacarídeos de leite humano, o que, por sua vez, pode levar a uma fórmula infantil de melhor qualidade que imita mais de perto o leite materno humano e ajuda a diminuir a distância entre bebês amamentados e alimentados com fórmulas.
Recomenda-se a discrição do usuário ao decidir qual método usar para remoção de lactose com base no custo, rendimento e disponibilidade do equipamento. Deve-se tomar cuidado para garantir a remoção ideal da lactose. Um dia antes do experimento, sementes 5 mililitros de meio LB suplementados com kanamicina e carbenicilina de uma colônia bacteriana fresca usando técnicas estéreis.
Incubar todas as culturas durante a noite a 37 graus Celsius com agitação. No dia seguinte, transfira 50 microliters de uma cultura noturna em cinco mililitros de mídia LB M9 fresca com kanamicina e carbenicilina. Incubar a 37 graus Celsius com agitação contínua até que a cultura tenha atingido um OD600 entre zero ponto cinco e zero ponto sete.
Primeiro, transfira as culturas da noite para um ponto cinco mililitros e centrífuga a 12.500 vezes g por um minuto. Descarte o supernatante e suspenda a pelota em 500 microliters de 1x PBS para preparar uma única suspensão celular. Transfira a suspensão de célula única para tubos de fax.
Use um cítmetro de fluxo para excitar o GFP e coletar níveis de fluorescência FITC conforme descrito no protocolo de texto. Para fazer uma curva de calibração, faça de oito a 10 diluições do padrão 2'FL na faixa entre zero e 2500 miligramas por litro. Cultue as células de biosensoante de 2'FL e induza-as com as diluições padrão, conforme descrito no protocolo de texto.
Inicie uma cultura de uma cepa de produção de 2'FL em cinco mililitros de mídia LB e cresça durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, a subcultura a 1%em 250 mililitros de mídia mínima preparada e adiciona glicerol a uma concentração final de 10 gramas por litro. Incubar a 37 graus Celsius até que a cultura atinja e OD600 entre zero ponto cinco e zero ponto sete.
Em seguida, adicione IPTG a uma concentração final de zero ponto cinco milimólares e lactose a uma concentração final de dois gramas por litro. Incubar a 37 graus Celsius com agitação contínua por 24 horas. No dia seguinte, transfira a cultura da noite para tubos estéreis de 50 mililitros e centrífuga a 900 vezes g por 15 minutos.
Descarte o supernatante e suspenda a pelota em água deionizada. Repita esta lavagem três vezes para remover qualquer lactose residual. Depois disso, suspenda a pelota em cinco mililitros de água deionizada.
Coloque as células no gelo e use um sonicator a 30% de potência em pulsos de 30 segundos para lise a suspensão da célula. Centrifugar as células líssedas a 2.000 vezes g por 25 minutos. Remova o supernante e passe-o através de um filtro estéril.
Armazene o supernante filtrado a quatro graus Celsius até estar pronto para analisar. Em seguida, inocular uma cultura de células biosensiculadas de 2'FL. Na fase de tronco médio, induza as células com o lisecelular em concentrações equivalentes às das 2'FL usadas para fazer a curva de calibração.
Realize a calibração conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, execute as amostras em um citómetro de fluxo. Gere uma curva de resposta de dose plotando a saída de fluorescência contra a concentração de oligossacarídeo e compare a resposta dos padrões ao liseto celular.
Primeiro, dissolver fl alfalisado beta galactosidase para 1.000 unidades por mililitro em um cloreto de magnésio milimila. Para determinar a concentração ideal de enzima necessária, cresça um inóculo de células biosensíveis de 2'FL e na fase de tronco médio, induza com lactose e FL de 2'FL. Para 100 culturas de microliter, adicione quantidades variáveis de beta galactosidase até 12 unidades.
Que as culturas cresçam da noite para o dia a 37 graus Celsius com agitação contínua. Meça a fluorescência conforme descrito no protocolo de texto e calcule as unidades ideais de enzima necessárias, determinando a concentração mínima de enzimas para alcançar a atenuação desejada do sinal. Às células produtoras de 2'FL cultivadas por 24 horas, adicione as unidades ideais de beta galactosidase e incubar durante a noite a 37 graus Celsius, determinar a titulação de 2'FL como descrito anteriormente.
Primeiro, inicie uma cultura de 25 mililitros de uma cepa produtora de 2'FL. Uma vez que a cepa é induzida na fase de registro médio, incubar a cultura a 37 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, inocular uma cultura E.coli BL21 na mídia LB.
Cresça-o até a fase de registro médio a 37 graus Celsius e adicione 15 mililitros desta cultura à cultura 24 horas 2'FL. Incubar a 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, determine a titulação de 2'FL como descrito anteriormente.
Para começar, inicie uma cultura de 25 mililitros de uma cepa produtora de 2'FL. Uma vez que a cepa é induzida na fase de registro médio, incubar a cultura a 37 graus celsius por 24 horas. Adicione dois volumes de 100% de etanol à cultura e agite bem.
Incubar a 37 graus Celsius por quatro horas. Em seguida, centrifufique a suspensão em 900 vezes g por 15 minutos. Colete o supernaspe e incubar durante a noite a quatro graus Celsius para precipitar a lactose.
Passe a solução através do papel filtro para remover a lactose precipitada. Colete o filtrado que contém o lisecelular e determine o titulação de 2'FL como descrito anteriormente. Neste estudo, uma estratégia de alto rendimento é utilizada para a detecção específica de ligação de oligossacarídeos de leite humano fucosilados.
Isso é feito através da construção de bio-sensores celulares inteiros pela engenharia genética E.Coli que, após indução com glicanos específicos, respondem com um sinal fluorescente. O sinal fluorescente sob diferentes condições de indução, conforme analisado em um citômetro de fluxo, mostra mais de 100 vezes um aumento na fluorescência com o biosenso de 2'FL em comparação com o controle do vetor apenas ou o biosenso para 3'FL. Isso mostra a alta especificidade de ligação do biosenso.
A sensibilidade do ensaio pode ser determinada gerando uma curva de resposta a doses com diferentes níveis de carboidratos. A faixa linear dinâmica de detecção de 2'FL, é vista entre 40 e 400 miligramas por litro e o limite de detecção é de quatro miligramas por litro. Este ensaio pode ser realizado ao longo de um dia de trabalho, como visto nas medições de snap shot da dinâmica da expressão do repórter.
As células de biosensação podem ser usadas para detectar e quantificar 2'FL de uma cepa de produtor de 2'FL projetada usando uma série de estratégias para reduzir o sinal de lactose exógena de modo que o sinal lido corresponderia diretamente à concentração de 2'FL. Uma estratégia é degradar enzimaticamente a lactose usando uma galactosidase beta que não age sobre lactose modificada. Outra estratégia utilizou o etanol que não só precipita seletivamente a lactose, mas também lise as células produtoras, uma vez que a lise celular é um passo necessário para baixo do fluxo.
Finalmente, o método mais eficaz, mas demorado, é a dotização e lavagem das células antes da lise celular para liberar o fl intracelular de 2'FL. Uma vez estabelecido esse método, conseguimos expandir o repertório de alvos oligossacarídeos usando diferentes enzimas. Atualmente, podemos detectar nove oligossacarídeos diferentes e estamos trabalhando em mais.
Ao otimizar este ensaio, notamos que a robustez de nossas enzimas nos permitiu chegar a uma técnica que dá uma leitura específica de linkage em cerca de cinco minutos. Embora nenhum dos reagentes utilizados aqui seja particularmente perigoso, aqueles que utilizam este método devem seguir procedimentos padrão de risco biológico e bioconsínuo, incluindo o uso de EPI adequado.
