Questo metodo può aiutare a rispondere a diverse domande chiave coinvolte nella produzione di oligosaccaridi del latte umano. Innanzitutto, quanta parte del prodotto ho? E in secondo luogo, qual è il collegamento specifico dei carboidrati?
L'obiettivo è semplificare e accelerare il processo di quantificazione e caratterizzazione di questi oligosaccaridi del latte umano. Questo metodo ha due vantaggi rispetto allo stato attuale dell'arte. In primo luogo, è suscettibile allo screening ad alta produttività.
Quindi, potete immaginare di testare migliaia di condizioni diverse o forse anche una libreria di enzimi di sintesi in un giorno usando questa tecnica. Inoltre, utilizza l'esclusiva specificità del substrato che la natura ha evoluto negli enzimi per darci informazioni sul collegamento dei carboidrati di quegli oligosaccaridi. Riteniamo che questo metodo possa migliorare la produzione di oligosaccaridi del latte umano, il che a sua volta può portare a alimenti per lattanti di migliore qualità che imitano più da vicino il latte materno umano e aiutano a colmare il divario tra i bambini allattati al seno e nutriti con alimenti.
La discrezione dell'utente è consigliata quando si decide quale metodo utilizzare per la rimozione del lattosio in base al costo, alla velocità effettiva e alla disponibilità delle apparecchiature. Si deve fare attenzione a garantire una rimozione ottimale del lattosio. Il giorno prima dell'esperimento, seme 5 millilitri di mezzo LB integrati con kanamicina e carbenicillina da una colonia batterica fresca utilizzando tecniche sterili.
Incubare tutte le culture durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione. Il giorno successivo, trasferire 50 microlitri di una coltura notturna in cinque millilitri di supporti LB M9 freschi con kanamicina e carbenicillina. Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimenti continui fino a quando la coltura non ha raggiunto un OD600 tra zero punto cinque e zero punti sette.
In primo luogo, trasferire le colture notturne in un punto cinque tubi millilitro e centrifugare a 12.500 volte g per un minuto. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 500 microlitri di 1x PBS per preparare una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione a cella singola in tubi fax.
Utilizzare un citometro a flusso per eccitare la GFP e raccogliere i livelli di fluorescenza FITC come delineato nel protocollo di testo. Per effettuare una curva di calibrazione, effettuare da otto a 10 diluizioni del 2'FL standard nell'intervallo compreso tra zero e 2500 milligrammi per litro. Culturare le cellule di biorilevamento 2'FL e indurle con le diluizioni standard delineate nel protocollo di testo.
Inizia una cultura di un ceppo di produzione 2'FL in cinque millilitri di supporti LB e coltivalo durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, sottocultura all'1% in 250 millilitri di mezzi minimi preparati e aggiungere glicerolo a una concentrazione finale di 10 grammi per litro. Incubare a 37 gradi Celsius fino a raggiungere la coltura e OD600 tra zero punto cinque e zero punti sette.
Quindi aggiungere IPTG a una concentrazione finale di zero punti cinque millimolare e lattosio a una concentrazione finale di due grammi per litro. Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento continuo per 24 ore. Il giorno successivo, trasferire la coltura notturna su tubi sterili da 50 millilitri e centrifugare a 900 volte g per 15 minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in acqua deionizzata. Ripetere questo lavaggio tre volte per rimuovere eventuali lattosio residuo. Successivamente, sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di acqua deionizzata.
Posizionare le cellule sul ghiaccio e utilizzare un sonicatore al 30% di potenza in impulsi di 30 secondi per lisciviare la sospensione cellulare. Centrifugare le cellule liti a 2.000 volte g per 25 minuti. Rimuovere il supernatante e passarlo attraverso un filtro sterile.
Conservare il supernatante filtrato a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'analisi. Successivamente, inoculare una coltura di cellule di biorilevamento 2'FL. Nella fase di registro intermedio, indurre le cellule con il llysato cellulare a concentrazioni equivalenti a quelle di quei 2'FL utilizzati per effettuare la curva di taratura.
Eseguire la calibrazione come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, eseguire i campioni su un citometro a flusso. Generare una curva di risposta alla dose tracciando l'uscita di fluorescenza rispetto alla concentrazione di oligosaccaride e confrontare la risposta degli standard con il lisato cellulare.
In primo luogo, sciogliere fl alfalyzed beta galattosidasi a 1.000 unità per millilitro in un cloruro di magnesio millimolare. Per determinare la concentrazione ottimale di enzima necessaria, far crescere un inoculo di cellule di biorilevamento 2'FL e nella fase di registro intermedio, indurre con lattosio e 2'FL. A 100 colture di microliteri, aggiungere quantità variabili di beta galattosidasi fino a 12 unità.
Lascia che le culture crescano durante la notte a 37 gradi Celsius con continui scuotimenti. Misurare la fluorescenza descritta nel protocollo di testo e calcolare le unità ottimali di enzima necessarie determinando la concentrazione minima enzimatica per ottenere l'attenuazione del segnale desiderata. A 2'FL cellule produttrici coltivate per 24 ore aggiungere le unità ottimali di beta galattosidasi e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius, determinare il titolo 2'FL come descritto in precedenza.
Per prima cosa, inizia una coltura da 25 millilitri di un ceppo di produzione 2'FL. Una volta che il ceppo è indotto nella fase di log medio, incubare la coltura a 37 gradi Celsius per 24 ore. Successivamente, inoculare una cultura E.coli BL21 nei media LB.
Coltivalo fino alla fase di registro intermedio a 37 gradi Celsius, quindi aggiungi 15 millilitri di questa cultura alla cultura 2'FL di 24 ore. Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi, determinare il titolo 2'FL come descritto in precedenza.
Per iniziare, inizia una coltura di 25 millilitri di un ceppo di produzione 2'FL. Una volta che il ceppo è indotto nella fase a metà log, incubare la coltura a 37 gradi celsius per 24 ore. Aggiungere due volumi di etanolo al 100% alla coltura e agitare bene.
Incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore. Quindi, centrifugare la sospensione a 900 volte g per 15 minuti. Raccogliere il supernatante e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius per far precipitare il lattosio.
Passare la soluzione attraverso la carta da filtro per rimuovere il lattosio precipitato. Raccogliere il filtrato che contiene il lisato cellulare e determinare il titolo 2'FL come descritto in precedenza. In questo studio, viene utilizzata una strategia ad alta produttività per il rilevamento specifico del collegamento di oligosaccaridi di latte umano fucosilati.
Ciò si ottiene costruendo bio-sensori interi a cellule dall'ingegneria genetica E.Coli che, al momento dell'induzione con glicani specifici, rispondono con un segnale fluorescente. Il segnale fluorescente in diverse condizioni di induzione, come analizzato su un citometro di flusso, mostra un aumento di 100 volte della fluorescenza con il biosensore 2'FL rispetto al controllo solo vettoriale o al biosensore per 3'FL. Questo mostra l'elevata specificità di collegamento del biosensore.
La sensibilità del saggio può essere determinata generando una curva di risposta alla dose con vari livelli di carboidrati. La gamma lineare dinamica di rilevamento 2'FL, è considerata compresa tra 40 e 400 milligrammi per litro e il limite di rilevamento è di quattro milligrammi per litro. Questo saggio può essere effettuato nel corso di una giornata lavorativa come si vede nelle misurazioni a scatto della dinamica dell'espressione del reporter.
Le cellule di biorilevamento possono essere utilizzate per rilevare e quantificare 2'FL da un ceppo di produzione 2'FL ingegnerizzato utilizzando una serie di strategie per ridurre il segnale dal lattosio esogeno in modo che il segnale letto corrisponda direttamente alla concentrazione di 2'FL. Una strategia è quella di degradare enzimaticamente il lattosio usando una beta galattosidasi che non agisce sul lattosio modificato. Un'altra strategia ha utilizzato l'etanolo che non solo precipita selettivamente il lattosio, ma lelysisce anche le cellule produttrici poiché lalisi delle cellule è un passo verso il basso necessario.
Infine, il metodo più efficace ma dispendioso in termini di tempo è quello di pelletare e lavare le cellule prima dellalisi cellulare per rilasciare il 2'FL intracellulare. Una volta stabilito questo metodo, siamo stati in grado di espandere il repertorio di bersagli di oligosaccaridi usando diversi enzimi. Attualmente, possiamo rilevare nove diversi oligosaccaridi e stiamo lavorando su di più.
Durante l'ottimizzazione di questo saggio, abbiamo notato che la robustezza dei nostri enzimi ci ha permesso di trovare una tecnica che dà un collegamento specifico letto in circa cinque minuti. Sebbene nessuno dei reagenti qui utilizzati sia particolarmente pericoloso, coloro che utilizzano questo metodo dovrebbero seguire procedure standard di biohazard e biocontenimento, incluso l'uso di DPI adeguati.
