Este protocolo usa um método simples para melhorar a confiabilidade de um modelo de cultura celular 3D sem o uso de qualquer equipamento especial. A principal vantagem dessa técnica é que podemos realizar o experimento de cultura 3D repetitivo controlando a condição de cultura inicial dentro do dispositivo cúbico. Depois de preparar uma estrutura cúbica de policarbonato de cinco por cinco milímetros, coloque o quadro em um slide pré-resfriado e uma caixa de gelo e use uma pipeta para adicionar 12 microliters de 1,5% de agarose pré-aquecido da face superior do quadro cúbico para a superfície inferior.
Espalhe a agarose para obter uma superfície plana e permitir que o polímero cure. Use pinças para deslizar a moldura até a borda do vidro e girar a moldura para que o lado aberto fique virado para baixo antes de colocar a moldura de volta no slide. Depois de encher as duas superfícies seguintes do quadro com mais agarose, como apenas demonstrado, solte a agarose em um recipiente de um rosto aberto para formar uma parede agarose no quarto e quinto lados.
Para configurar uma forma inicial de cluster celular, injete uma matriz extracelular apropriada para a cultura celular de interesse no espaço de cultura do cubo de gel híbrido e coloque um micro molde fabricado no cubo. Em seguida, coloque o cubo em uma incubadora de dióxido de carbono por 25 minutos a 37 graus Celsius. Quando a matriz extracelular estiver curada, levante cuidadosamente o micro molde para que a matriz não se deteriore.
Um bolso na forma de molde desejado será fabricado na matriz extracelular. Para carregar as células concentram a suspensão celular experimental após a centrifugação no meio de cultura celular experimental apropriada e injetam as células no bolso dentro da matriz extracelular. Coloque o cubo na incubadora de dióxido de carbono por 20 minutos a 37 graus Celsius para permitir que as células caiam no bolso da matriz extracelular, preenchendo o espaço criado pelo micro molde.
No final da incubação, coloque o cubo em um poço de uma placa de 24 poços e adicione 100 microliters do meio de cultura celular adequado ao poço. Injete matriz extracelular adicional para fechar o bolso e devolver o cubo à incubadora por 25 minutos. Quando a matriz extracelular é curada, queda de aproximadamente 10 microliters de 20 graus Celsius surgiu na superfície superior do cubo para fechar a superfície e curar a queda por 10 a 20 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, cubra todo o cubo com meio fresco para promover a pressão osmótica para facilitar a transferência de nutrição para as células dentro do cubo. Para reconhecimento de forma 3D não invasiva por observação multidirecional, coloque a placa em um estágio de microscópio e obtenha imagens de cada lado do cubo por microscopia de contraste de campo brilhante ou fase, usando pinças para girar o serviço cubo a ser imageado entre capturas. Para imagens imunofluorescentes por observação multidirecional, primeiro aspire o supernascido do poço que contém o cubo e fixe o cubo em 4% de paraformaldeído por 20 minutos à temperatura ambiente.
No final da fixação, lave o cubo duas vezes com PBS por 10 minutos por lavagem. Impermeabiliza o cubo com 0,5%triton x-100 e PBS por 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o cubo três vezes em PBS por 10 minutos por lavagem, antes de bloquear qualquer ligação inespecífica com soro de cabra e tampão de imunofluorescência por 60 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, colori as células com o anticorpo primário apropriado de interesse de acordo com protocolos padrão de coloração de anticorpos. Em seguida, imagine todos os seis lados do cubo em um laser ou microscópio fluorescente como apenas demonstrado. Neste experimento representativo, a imagem multidirecional de cubos de gel híbridos, cultivada com células epiteliais brônquicas humanas normais, demonstra a geração de uma cultura celular cilíndrica ou prisma inicial por contraste de fase e imagem imunofluorescente das culturas.
Aqui a coloração imuno de células epiteliais humanas normais inicialmente controladas a uma forma cilíndrica no cubo de gel híbrido, após a geração da árvore brônquica é mostrada. Os ramos demonstram o perpendicular ao eixo cilíndrico, conforme revelado pela imagem multidimensional. É importante injetar uma alta densidade de células no bolso da matriz extracelular, pois uma baixa densidade de células pode resultar em deterioração da qualidade dessa célula após a incubação.
Este padrão de método é a formação repetível de um padrão celular 3D com uma medição quantitativa por imagem multidirecional para estudar o mecanismo de desenvolvimento de pratos.
