O teste de sinergia manual do array do checkerboard é um método intensivo em mão-de-obra e propenso a erros. Em contraste, nosso método automatizado de placa de verificação baseado em impressora a jato de tinta melhora drasticamente a velocidade, a precisão e o throughput. O método automatizado de checkerboard permite a triagem de um grande número de drogas para combinações sinérgicas, enquanto o método de morte por tempo pode confirmar e explorar ainda mais a atividade dessas combinações.
A nova descoberta de antibióticos não está acompanhando a propagação da resistência, mas a investigação de combinações sinérgicas oferece uma possibilidade de salvar medicamentos existentes para tratar bactérias resistentes. Embora demonstremos essa técnica com antibacterianos, ela também poderia ser usada com outras classes de antimicrobianos ou mesmo para diferentes tipos de testes combinados de drogas ou compostos. Neste vídeo, demonstramos um método automatizado de matriz de tabuleiro de xadrez e um método manual de morte de tempo.
Sugerimos a realização de estudos de matriz de checkerboard primeiro para identificar combinações promissoras, em seguida, investigar-los mais adiante com estudos de morte por tempo. Para começar, faça soluções de estoque antimicrobiano de colistina e minocíclina e, em seguida, realize o controle de qualidade sobre as soluções de estoque, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, adicione cerca de um mililitro de cloreto de sódio de 0,9%, salino, a tubos de cultura de vidro redondo de 12 milímetros por 75 milímetros.
Selecione uma ou duas colônias de uma placa de bactérias durante a noite, e coloque-as nos tubos de cultura. Vórtice os tubos suavemente para suspender as bactérias na solução. Verifique a concentração de bactérias usando um leitor McFarland.
Ajuste a concentração adicionando mais soro fisiológico ou mais bactérias para obter uma leitura de turbidez mcfarland de 0,5. Em seguida, diluir a bactéria de um a 300 adicionando 100 microliters da suspensão a 30 mililitros de caldo Mueller-Hinton ajustado em um tubo cônico de 50 mililitros para atingir uma densidade celular final de cinco vezes 10 para a quinta colônia-formadora de unidades por mililitro. Agora, prepare os antimicrobianos para impressão seguindo o protocolo de texto que acompanha.
Salve o protocolo e clique no botão Executar no canto superior esquerdo, seguido pelo botão Iniciar. Coloque uma placa de 384 poços no suporte da placa e pressione carregado sob o prompt de Sinergia da Placa de Carga 1. Em seguida, coloque um T8+no slot do e pressione carregado sob o prompt De carregar um T8+Cassette.
Quando solicitado, adicione a solução de estoque de antibióticos aos reservatórios indicados no. Depois de cada solução ser adicionada, pressione o botão Preenchido. Uma vez que o Distribuidor D300 tenha adicionado estoque de antibióticos em volumes apropriados a cada poço e a caixa Run Completed apareça, clique em Fechar, remova a placa e desligue o D300.
Em seguida, despeje a suspensão bacteriana previamente preparada em um reservatório de reagente estéril. Use uma pipeta multicanal para adicionar 50 microliters da suspensão a todos os poços da matriz de xadrez. Em seguida, adicione 50 microliters de caldo Mueller-Hinton ajustado sem bactérias a um poço vazio.
Este será o controle negativo bem para confirmar a esterilidade da mídia. Incubar em uma incubadora de ar ambiente Celsius de 35 graus por 16 a 20 horas. Para analisar o teste, acompanhe o protocolo de texto que acompanha.
Para o teste de sinergia de morte por tempo, prepare novamente as soluções de estoque antimicrobianos, conforme descrito no protocolo de texto. Então, faça uma suspensão de 0,5 McFarland do organismo de teste em solução salina estéril. Adicione 100 microliters da suspensão 0,5 McFarland a cinco mililitros de CAMHB em um tubo de cultura de fundo redondo de vidro de 25 por 150 milímetros com fechamento de aço inoxidável, e vórtice suavemente para misturar.
Usando um laço inoculante estéril, o isolamento é uma gota da suspensão diluída em uma placa de ágar de sangue, e incuba a placa a 35 graus Celsius no ar ambiente para confirmar a pureza do inóculo. Substitua o fechamento no tubo e incuba-o em um rack de tubo de ensaio em um agitador a 35 graus Celsius no ar ambiente por pelo menos 3 horas, até que o crescimento da fase logarítmica seja atingido. Enquanto a cultura inicial está incubando, adicione 10 mililitros de caldo Mueller-Hinton ajustado à cation a cinco tubos de cultura de vidro autoclaved.
Para um estudo de sinergia de morte por tempo, pelo menos uma droga deve estar em uma concentração que não afeta a curva de crescimento individualmente. Isso pode ser determinado avaliando os efeitos das concentrações individuais de medicamentos antes do estudo de sinergia. Ao primeiro tubo, adicione 10 microlitadores de um miligrama por mililitro de colistina para obter uma concentração final de colistina de um micrograma por mililitro, pois esta é uma concentração que é ineficaz contra a cepa usada neste exemplo.
Para o segundo tubo, adicione 10 microlitadores de estoque de minocíclina de um miligrama por mililitro para obter uma concentração final de um micrograma por mililitro. Esta concentração também é ineficaz contra a tensão que está sendo utilizada neste exemplo. Ao terceiro tubo, adicione 10 microlitadores de estoque de minocycline de um miligrama por mililitro e 10 microliters de um miligrama por mililitro de colistina.
Esta é a mesma quantidade de colistina e minocíciclina usada nos tubos um e dois. No quarto e quinto tubos, não adicione antibióticos. Este será o controle de crescimento e os tubos de controle negativos, respectivamente.
Em seguida, prepare 96 placas de polipropileno de poço profundo com poços de dois mililitros para diluições seriais adicionando 900 microliters de soro fisiológico estéril às linhas B através de H de colunas de um a quatro com uma pipeta multicanal. Quando a cultura estiver em fase de crescimento logarítmico, remova o tubo de cultura do agitador, e o vórtice dele suavemente. Transfira um mililitro da suspensão para um tubo de cultura de vidro de 12 por 75 milímetros e verifique a densidade com um leitor McFarland.
Se a densidade for inferior a 1,0 McFarland, devolva o tubo ao agitador e incubar por mais tempo. Se for maior que 1,0 McFarland, adicione caldo Mueller-Hinton ajustado ao tubo, vórtice suavemente e re-amostra até que a suspensão esteja em 1.0 McFarland. É importante que a cultura esteja em fase de crescimento logarítmico ao preparar o inóculo inicial.
Você pode construir uma curva de crescimento para determinar quando um organismo atinge esta fase. Em seguida, adicione 100 microliters da suspensão 1.0 McFarland aos tubos de um a quatro, e vórtice-los suavemente. Imediatamente após a mistura e em uma, duas, quatro, seis e 24 horas, remova uma alíquota de 150 microliteres de cada tubo de cultura inclinando o tubo para que apenas a ponta de pipeta estéril entre no tubo e não no eixo do pipettor não estéril durante a retirada de alíquotas.
Adicione alíquotas, respectivamente, a poços consecutivos na primeira linha da placa de 96 poços profundos previamente preparada. Retorne os tubos a um rack de tubo de ensaio em um agitador em uma incubadora de ar ambiente Celsius de 35 graus imediatamente após a remoção de alíquotas em cada ponto de tempo. Usando uma pipeta multicanal, remova 100 microliters da linha A da placa e adicione-a à linha B, contendo 900 microliters de soro fisiológico, criando uma diluição de um a 10.
Pipeta a solução para cima e para baixo quatro a cinco vezes para misturar, e depois descartar as pontas. Primeiro, rotule as placas de ágar Mueller-Hinton com as condições de antibiótico e diluição a serem banhadas. Em seguida, as amostras diluídas para colônia conta usando o método de placa de gota, usando uma pipeta multicanal com pontas extra-longas.
Remova 10 microliters de cada poço na primeira coluna e distribua cuidadosamente em uma fileira sobre a placa devidamente rotulada. Continue até que todas as linhas sejam distribuídas nas placas. Além disso, no ponto de tempo de 24 horas, coloque uma gota de 10 microliter tirada diretamente do tubo de controle negativo para o local dedicado a isso, a fim de testar a esterilidade.
Em seguida, inverta todas as placas, e incuba-as durante a noite a 35 graus Celsius no ar ambiente. Então, conte o número de colônias em cada área, e calcule a densidade celular. Marque colônias com um marcador permanente de ponta fina no verso da placa para evitar contagem dupla ou colônias ausentes.
Para cada série de diluição, identifique gotas com três a 30 colônias. Conte as colônias nestas gotas, e regisse a contagem junto com o fator de diluição. Mostrado aqui é uma grade de um experimento de sinergia de matriz de xadrez em que a minocícica em concentrações de zero a 32 microgramas por mililitro foi combinada com colistina em concentrações de zero a 16 microgramas por mililitro e testada contra uma cepa de E.coli.
Poços com valores OD600 abaixo de 07 não representam crescimento e são sombreados de vermelho, enquanto poços com valores OD600 acima ou iguais a 07 representam crescimento e são sombreados verdes. Para cada droga, a concentração inibitória mínima é a menor concentração de droga que inibe o crescimento bacteriano. Para a minocíciclina, são 32 microgramas por mililitro, e para colistina, são oito microgramas por mililitro.
O sombreamento é mantido aqui, mas os valores dentro dos poços em que o crescimento é inibido são substituídos por concentração inibitória fracional, ou FIC, valores de índice. Em cada poço, o índice FIC de cada droga é calculado dividindo a concentração de antibiótico naquele poço pela concentração inibitória mínima da droga. Poços com um índice FIC inferior ou igual a 0,5, que é considerado o limite para sinergia, são indicados com uma borda de linha quebrada, e o poço com o menor índice FIC é arrojado.
Como o valor mínimo do FIC está na faixa sinérgica, a combinação é considerada sinérgica. Um exemplo de caso que não demonstra sinergia é mostrado aqui, pois o índice FIC mínimo no qual o crescimento é inibido é um, que é superior a 0,5. Finalmente, neste exemplo, ocorreram vários poços ignorados, o que representa o crescimento bacteriano inibido, apesar da presença de crescimento bacteriano em poços adjacentes com maiores concentrações de antibiótico.
Se mais de um pulou bem ocorreu em uma matriz de tabuleiro de xadrez, os resultados devem ser descartados e o ensaio repetido. Um exemplo de um gráfico demonstrando resultados de um ensaio de sinergia de morte de tempo é apresentado aqui. Consulte o protocolo de texto que acompanha os detalhes sobre a interpretação do ensaio de sinergia de morte de tempo.
Mais informações sobre a atividade de combinações sinérgicas podem ser obtidas através de avaliações de farmacocinética e farmacodinâmica e através de estudos in vivo com modelos animais. Siga sempre os procedimentos de segurança adequados, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual, ao trabalhar com bactérias. Se você gerar aerossóis ou usar patógenos de alto risco, realize todo o trabalho em um armário de biossegurança.
