O modelo de chorume cecal para sepse polimicrobiana é uma poderosa ferramenta para dissecar a fisiopatologia neonatal única. Pode ser variável, e os pontos finais humanos não são bem descritos. Aqui apresentamos nosso procedimento altamente padronizado para preparar um chorume cecal e injetar em animais experimentais.
Além disso, usamos uma abordagem baseada em dados para identificar filhotes moribundos o mais cedo possível. Vamos começar preparando um caldo de chorume cecal congelado. Isso é feito agrupando concent cecal de pelo menos cinco ratos adultos, suspendendo em água dextrose estéril, e armazenando a menos 80 para uso posterior.
Você pode usar machos ou fêmeas, mas o sexo, idade e fundo de ratos para seus experimentos devem ser mantidos constantes. Primeiro, vamos preparar nossas ferramentas para dissecção. Estes incluem um conjunto de tesouras e fórceps para a pele e um segundo conjunto para os órgãos internos.
Ligue o esterilizador de contas quentes pelo menos 30 minutos antes de usar. Mergulhe as ferramentas em 70% de etanol e depois submerse-as no esterilizador de contas quentes por pelo menos um minuto. Pulverize um tapete de toalhas de papel com 70% de etanol e remova as ferramentas do esterilizador sem tocar na parte esterilizada da ferramenta para as alças não estéreis de outras ferramentas.
Coloque-os na toalha de papel para esfriar. Dissecar os ratos em um armário de segurança biológica. Fixe as pernas do rato em uma placa de isopor usando agulhas de 23 medidores para que o rato esteja com o abdômen para cima.
Pulverize o abdômen com 70% de etanol. Usando fórceps estéreis e tesouras, corte a pele, solte a pele do revestimento peritônio com a tesoura e abra uma região retangular da virilha para o esterno e do lado esquerdo para o lado direito. Remova qualquer pele ao redor do peritônio.
Mude para um novo par de ferramentas estéreis para cortar o peritônio, também fazendo uma abertura retangular. Identifique o ceco, que deve estar correndo do lado esquerdo para o lado direito através do corpo. Interrompa o tecido conjuntivo para identificar os ramos ceco dos intestinos e corte o ceco longe dos intestinos.
Coloque-o em uma folha esterilizada de papel de pesar. Usando ferramentas estéreis, corte as duas extremidades do ceco. Segure o meio do ceco com fórceps e use uma espátula de metal plana para empurrar suavemente o conteúdo cecal para fora das extremidades usando um movimento de rolamento.
Colete o conteúdo e coloque-os em um tubo de centrífuga de 15 mililitros pré-pesado. Teor de cecal da piscina de um máximo de cinco ratos no mesmo tubo. Pesar o tubo novamente uma vez que todo o conteúdo foi adicionado.
Para calcular o volume de água dextrose para adicionar ao conteúdo cecal em cada tubo, divida o peso do conteúdo cecal no tubo pela concentração desejada em miligramas por mililitro. Mantenha uma alíquota de água dextrose no gelo para a re-suspensão do conteúdo cecal. Adicione a quantidade necessária de água dextrose ao tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo conteúdo cecal.
Vórtice o tubo vertical e horizontalmente por cerca de 30 segundos. Observe para a presença de partículas com mais de alguns milímetros de diâmetro, e se presente, continue o vórtice até que todas as partículas sejam visivelmente desaparecedas. Coloque um tubo de centrífuga de 50 mililitros no gelo para coletar o filtrado e instale um filtro de células estéril de 70 micrômetros por cima.
Pipeta quatro mililitros de chorume re-suspenso de um tubo de 15 mililitros sobre o coador de células e para o tubo de coleta. Suspenda as partículas se esticando duas a três vezes. Extrude suavemente bolhas para aumentar a velocidade de filtragem enquanto mexe o conteúdo com a ponta da pipeta até que não haja mais líquido sendo filtrado.
Isso deve levar cerca de 30 segundos. Altere os filtros celulares entre cada tubo de chorume cecal, mas cole toda a conteúdo no mesmo tubo de coleta de 50 mililitros. Se o seu estoque exceder 40 mililitros, então o vórtice por 15 segundos, e coloque 20 mililitros em um novo tubo de centrífuga.
Divida o chorume em frascos criogênicos de 500 alíquotas de microliter cada. Vórtice o chorume entre cada três frascos. Mantenha o estoque mestre em frascos no gelo.
Ao armazenar alíquotas a menos 80, a concentração da unidade de formação da colônia aeróbica em uma preparação de chorume cecal não muda durante um período de seis meses. Agora que o chorume cecal está preparado, podemos usá-lo para desafiar uma ninhada de camundongos de sete a oito dias de idade com uma dose de chorume cecal ajustada de peso. A letalidade do chorume é dependente de dose.
Você terá que determinar a dose letal desejada em sua instalação para cada novo estoque com uma nova dose de titulação. Uma alíquota de injeção de chorume cecal é preparada por ninhada. Normalizamos o inóculo para um volume de 100 microlitres, arredondando para os 10 microliters mais próximos para cada animal na ninhada.
Preparar a alíquota do desafio requer três cálculos, o volume de caldo necessário, o volume adicional de água de dextrose e o volume arredondado para cada filhote na ninhada. Detalhes sobre como realizar cada cálculo podem ser encontrados na seção três do protocolo. Realizar esses cálculos manualmente para cada experimento pode ser demorado e contribuir para erros experimentais, assim, uma planilha pode ser baixada juntamente com o protocolo onde você insira sua concentração de estoque, dose desejada e peso de sua ninhada, e a quantidade de caldo de chorume, volume de água de dextrose e volume real por filhote é automaticamente devolvida.
Você pode imprimir esta folha e levá-la com você quando estiver pronto para desafiar seus animais. Prepare a alíquota de injeção em um armário de segurança biológica e mantenha-a no gelo. Antes de carregar a seringa, misture o tubo de microcentrífuga mexendo 20 vezes.
Os filhotes são desafiados com uma seringa de insulina calibre 28. Antes de elaborar a chorume, misture a alíquota inspirando e ejetando de 300 a 500 microliters do desafio aliquot dentro e fora do tubo de microcentrifuuge. Em seguida, elasenhe cerca de 150 microliters da alíquota do desafio.
Isso deve ser maior do que o volume de injeção para qualquer filhote de sete a oito dias de idade. Bata na seringa para desalojar bolhas do êmbolo e puxe ligeiramente para trás na seringa para expulsar quaisquer bolhas de ar. Não toque na agulha ou no eixo do êmbolo durante este processo.
Dispense o excesso de chorume cecal de volta ao tubo de microcentrifuuge até que a quantidade calculada de chorume cecal para o rato seja carregada na seringa. O chorume cecal é administrado com uma injeção intraperitoneal. Faça isso de acordo com o protocolo em sua instituição de cuidados com animais.
Para minimizar os vazamentos, incline o filhote para o rosto para baixo e insira a agulha entre a perna e a genitália, mantendo a agulha rasa e subcutânea. Depois de inserir a agulha cerca de um centímetro, pressione para baixo e para frente até sentir a agulha perfurar o peritônio, em seguida, lentamente deprimir o êmbolo. Retire cuidadosamente a agulha seguindo a mesma rota que você entrou, relaxando seu dedo médio enquanto você faz isso.
Observe qualquer vazamento em seu caderno de laboratório e considere omitir animais com vazamentos substanciais do seu resultado final. Nesta seção delinearemos os diferentes níveis de saúde que observamos em camundongos desafiados com sepse polimicrobiana e seu ponto final humano correspondente. Para quaisquer procedimentos envolvendo camundongos neonatais, transferimos o material de cama para uma nova gaiola.
Isso transfere o cheiro da dama para suas luvas e reduz o estresse na dama de entrada repetida em sua gaiola. Fazemos um segundo ninho na nova gaiola para segurar os filhotes monitorados até o final do procedimento ou monitoramento quando toda a ninhada estiver pronta para ser devolvida à gaiola da dama. Coloque um mouse em suas costas e monitore para a capacidade de corrigir dentro de quatro segundos.
Se puder, espere mais oito segundos para determinar o nível de mobilidade. Um mouse incontestável ou em recuperação é mais frequentemente capaz de corrigir e explorar seu ambiente dando vários passos seguidos. Reagrupar ratos que são capazes de se endisenta e dar alguns passos para explorar seu ambiente como letárgico de direitos.
Esses ratos podem cair enquanto derem um passo e olhar trêmulos em seus pés. Um mouse que é incapaz de corrigir e tem movimento do quadril que excede 90 graus da horizontal que agrupamos como falha para o móvel direito. Este mouse eventualmente vai certo, mas não pode dentro de quatro segundos.
Por causa de seus movimentos de quadril, ele é agrupado como falha no móvel direito. Filhotes que não conseguiram corrigir e têm movimento do quadril abaixo de 90 graus da horizontal são agrupados como falham na letárgica direita. Este é outro exemplo de um rato cujos quadris não excedem 90 graus da horizontal e é agrupado como falha à direita letárgica.
Um filhote não-móvel que não tenha direito terá pernas que podem tremer ou vibrar, mas não têm movimento do quadril. Os membros podem se estender e se retrair, mas não terão movimento lateral. O filhote está visivelmente doente e atingiu o ponto final humano.
Este é outro exemplo de um filhote não-móvel de direita. Seus quadris não tremem da esquerda para a direita, mas suas patas vibram. Ao manusear a gaiola da dama, os filhotes podem ser arrastados para fora do ninho se a moça de enfermagem correr.
Nós substituímos estes e, em seguida, verificar para outros filhotes espalhados que estão longe de seus companheiros de ninho. Se esses filhotes dispersos não conseguirem a direita letárgica, eles estão em um ponto final humano. Aqui está uma curva de sobrevivência Kaplan-Meier do nosso modelo de sepse.
Os pontos de tempo de monitoramento podem ser encontrados no SOP anexado. Em qualquer momento ao longo da curva de sobrevivência se um rato é encontrado como falha ao não-mobilizado, ele está no seu ponto final humano e eutanizado. Entre 12 e 21 horas após o desafio, os ratos parecerão doentes e cerca de metade dos ratos serão capazes de direita de um lado, enquanto a outra metade não consegue acertar em nenhum de seus lados.
Este é o prazo em que os camundongos começarão a digress no escore de saúde e alcançarão o ponto final humano de não-mobilidade. São resultados representativos dos escores de saúde observados neste período. Os grupos de sobreviventes e não sobreviventes não podem ser diferenciados neste momento com base em seus escores de saúde.
Nesta fase da doença, de 21 a 48 horas após o desafio, observamos a maior proporção de pontos finais humanos. Observamos também que a grande maioria dos camundongos que não conseguem acertar em ambos os lados não acabará se recuperando da doença, o que se torna, portanto, um novo critério para o ponto final humano, além da falta de critérios de não-mobilidade. Os escores observados durante esta fase da doença resultaram na separação de sobreviventes de não sobreviventes.
A grande maioria dos camundongos que não conseguiram acertar em ambos os lados não se recuperou da doença. Esses dados sustentam que um novo critério para o ponto final humano a partir de 21 horas após o desafio deve ser eutanásia de quaisquer ratos que não consigam corrigir em ambos os lados. Ao longo de 48 horas após o desafio, muitos ratos começarão a exibir mais atividade e um reflexo melhor de direita.
Embora a proporção de pontos finais humanos sejam menores neste período, os camundongos ainda podem divagar e ficar mais doentes, e ainda requerem monitoramento para o ponto final humano. Durante esse período, alguns desses camundongos que foram eventualmente agrupados como não-sobreviventes apresentaram aumento da atividade em um ponto, mas mais tarde fizeram pior e atingiram um ponto final humano. Isso requer o monitoramento contínuo de animais doentes com maior frequência se começarem a apresentar piores desfechos de saúde.
Experimentadores independentes que não receberam treinamento presencial e que só observam este vídeo instrutivo foram testados em sua capacidade de atribuir a mesma pontuação que os investigadores usando vídeos de teste gravados. Este vídeo instrutivo resulta em classificação comportamental precisa. A capacidade de atribuir a pontuação correta para não conseguir os camundongos neonatais não móveis, que é uma medida de ponto final humano, foi determinada entre 60 camundongos neonatais, e uma média de 97% dos comportamentos foram precisamente distinguidos, com apenas 3% sendo identificados erroneamente.
Em seguida, foi testada a capacidade de diferenciar camundongos neonatais que não conseguiram corrigir ou que foram capazes de acertar em quatro segundos. Esta é outra medida de ponto final humano e foi atribuída com precisão em 97% dos camundongos neonatais, enquanto 3% dos filhotes foram incorretamente atribuídos como direito. Aqui estão os resultados representativos para a variação percentual de peso dos ratos em comparação com o seu tempo de desafio.
A mudança média de peso entre sobreviventes e não-sobreviventes começou a se separar em 24 horas após o desafio, mas há muita sobreposição entre os grupos. Houve alguns sobreviventes que perderam mais de 20% de peso, mas ainda se recuperaram da doença. A mudança de peso não foi tão eficiente na previsão do desfecho em comparação com as diferenças nos escores de saúde e é por isso que não é usada como critério para determinar se os camundongos estão em um ponto final humano.
Para concluir, agora você deve ser capaz de preparar um estoque de chorume cecal congelado, calcular a dose ajustada de peso. E injetar e monitorar camundongos recém-nascidos para pontos finais humanos. Esperamos que este seja um recurso valioso para sua pesquisa de mouse.
