Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo toxicológico da germinação humana, como como os danos no genoma das células germinativas primordiais humanas são criados ou reparados. A principal vantagem dessa técnica é que as células germinativas primordiais humanas podem ser geradas em duas semanas a partir das células de pluripotência primitivas que abrigam o fundo genético de predisposição da doença. As implicações dessa técnica se estendem para a prevenção do comprometimento genômico em células germinais humanas, porque nosso modelo de cultura celular pode nos ajudar a reduzir a toxicidade germinal de uma droga terapêutica.
Para começar com a geração de células germinativas primordiais humanas, ou PGCLCs humanos, preparem placas extracelulares revestidas de proteínas e suspensão celular de iPSCs humanos, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare uma suspensão unicelular de iPSCs humanos de pluripotência primed no meio mTeSR1 contendo o inibidor de quinase Rho Y-27632. Ajuste cuidadosamente a densidade celular para 100.000 células por mililitro.
Inocular dois mililitros de suspensão celular de iPSCs humanos preparados em cada poço da proteína de matriz extracelular revestida de seis poços, certificando-se de que as células são distribuídas uniformemente sacudindo as placas vertical e horizontalmente. Incubar as placas em uma incubadora de CO2 tri-gás a 37 graus Celsius. É muito importante inocular exatamente 200.000 células em cada poço de uma placa de seis poços.
A contagem precisa das células é crítica. Após a conclusão da conversão transitória para pluripotência ingênua, as células devem parecer super-confluentes, o que é normal. O tempo exato de mudança média é importante para alcançar pgclcs humanos elevados e reprodutibilidade experimental.
A densidade da cultura 4i hiPSC é alta nessas condições, e espera-se que as células se tornem confluentes nas 48 a 72 horas após a inoculação. 24 horas após a inoculação, troque o meio com dois mililitros por poço de mTeSR1 médio sem Y27632. Inicie a conversão de iPSCs humanos de estado pluripotency primed para 4i células-tronco pluripotentes ingênuos, aquecendo 50 mililitros de 4i meio completo em um banho de água de 37 graus Celsius por 15 minutos.
Às 48 e 72 horas após a inoculação, retire as placas da incubadora e troque o meio com 2 mililitros por poço de 4i meio completo. Centrifugar a placa de microwell revestida de detergente a 1.000 g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Inspecione os poços com microscópio invertido para garantir a ausência de bolhas de ar.
Enxágüe os poços conforme descrito no protocolo de texto e repita a centrifugação. Adicione 4i meio completo aos poços enxaguados. Centrifugar a placa a 1.000 g durante cinco minutos em temperatura ambiente, e inspecione os poços novamente.
Para inocular 4i iPSCs humanos na placa de microwell, prepare a suspensão celular iPSC humana, conforme descrito no protocolo. Filtre esta suspensão celular através de um coador de células de tamanho de poros de 40 micrômetros para remover agregados celulares. Lave o coador com um mililitro de 4i pré-aquecido meio completo três vezes para coletar todas as células do coador, e conte as células com um contador de cultura.
Em seguida, diluir esta suspensão celular única de 4i iPSCs humanos ingênuos para 27 a 32,4 milhões de células em 9 mililitros pré-aquecidos 4i meio completo contendo Y27632. Remova a placa de microwell previamente preparada contendo 1 mililitro de 4i meio completo por poço de uma incubadora de três gáss. Inocular 1 mililitro de 4i ingenuidade humana suspensão iPSC em cada poço, para alcançar uma concentração de 3,0 a 3,6 milhões de células por poço.
Pipeta suavemente para distribuir uniformemente as células. Centrifugar a placa a 100 g por 3 minutos em temperatura ambiente. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 tri-gás, certificando-se de não perturbar as células pelleted em microwells, e incubar por 24 a 30 horas, pois uma incubação noturna é insuficiente para a formação de corpos embrionários apertados ou EBs.
Pré-aquecimento 5 mililitros de meio basal pgclc humano e 20 mililitros de pgclc humano meio completo por pelo menos cinco minutos em um banho de água 37 graus Celsius Coloque cuidadosamente um coador de células do tamanho de um poro de 40 micrômetros de cabeça para baixo sobre um tubo de polipropileno de 50 milímetros. Para separar os EBs de microwells, bato suavemente cada poço da placa. Para remover células não incorporadas em EBs, filtrar o conteúdo de todos os poços através do coador celular.
Lave suavemente os EBs retidos na membrana do coador celular com 1 mililitro de meio basal PGCLC humano pré-aquecido e repita a lavagem cinco vezes. Coloque um tubo cônico fresco de 50 mililitros no coador celular, de modo que o coador de células esteja agora posicionado do lado direito para cima no novo tubo. Inverta rapidamente o coador celular com o novo tubo, que posicionará os EBs abaixo da membrana do coador celular.
Adicione 18 mililitros de PGCLC humano pré-aquecido meio completo à membrana do coador celular para coletar EBs no tubo cônico. Em seguida, a placa 3 mililitros por poço da suspensão de EBs em poços de uma placa de seis poços de baixa fixação. Coloque a placa em um roqueiro de movimento de gangorra em uma incubadora de três gáss, e coloque cuidadosamente a velocidade de balanço em aproximadamente 20 voltas por minuto.
No sétimo dia a 13 do experimento, preparem recentemente 20 mililitros de pgclc humano completos por dia. Retire a placa do roqueiro, o que fará com que os EBs afundem até o fundo dos poços. Remova o meio antigo sem secar EBs de modo que cerca de 0,2 mililitros de médio antigo permaneça em cada poço.
Adicione 3 mililitros por poço de meio completo pgclc humano fresco, depois de remover o antigo meio todos os dias. Para identificar pgclcs humanos como células OCT4 positivos, colher os EBs para um tubo de microcentrifuge de baixa ligação de 1,5 mililitro. Deixe os EBs afundarem até o fundo à temperatura ambiente e descarte o meio.
Enxágüe os EBs com PBS 1X frio. Depois de remover o PBS, incubar os EBs em 1 mililitro de gelo frio 1% de peso em volume de azida de sódio em PBS no gelo por cinco minutos. Deixe os EBs afundarem até o fundo à temperatura ambiente.
Depois de descartar o supernasce, enxágue os EBs com PBS gelado. Descongele 200 microliters de proteína de matriz extracelular no gelo. Adicione a proteína ao tubo que contém EBs.
Deixe o tubo em temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos, até que o gel esteja solidificado, e os EBs estejam embutidos. Para fixar os EBs, adicione 1 mililitro de 4% de formaldeído no PBS ao tubo e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos com balanço suave. Depois disso, descarte o formaldeído e enxágue os EBs uma vez com PBS gelado.
Adicione 1 mililitro de 70% de etanol. Armazene 70% de etanol a 4 graus Celsius por até uma semana, ou prossiga para processá-los com um protocolo padrão FFPE. A densidade celular e até mesmo a distribuição de células em cada poço são críticas.
IpSCs humanos em 2 mililitros de Y27632 complementados médios por poço de uma placa de seis poços, atingem 20 a 30% de confluência após 24 horas. Após mais 24 horas de cultura no meio mTeSR1, na ausência de Y27632, as células agregaram e formaram colônias, ocupando aproximadamente 30% da área de crescimento. Após 24 horas de cultura no meio de reprogramação 4i, as células atingiram a confluência.
Depois de mais 24 horas de cultura no meio 4i, as células ficaram mais densamente embaladas. Após uma incubação de 24 horas em microwells no meio de reprogramação 4i, as células formaram EBs com seu contorno circular visível entre 24 e 30 horas após a inoculação. Os EBs mantidos no meio pgclc humano, sob condições nãoadherent, mantiveram sua forma esférica sem agregação após 24 horas.
Após 192 horas, os EBs foram maiores, mantendo a mesma morfologia. Após 5 dias, as células emergiram como CÉLULAS DE EXPRESSÃO OCT4 na superfície dos EBs, aumentando seu número após 8 dias. As células de suspensão de células únicas de PGCLCs humanos foram enriquecidas como células CD38 positivas pelo FACS.
As células que não expressam CD38 foram de controle negativo. Para evitar contaminação, as células CD38-positive e CD38 negativos foram separadas por uma ampla margem. Ao tentar este procedimento, é importante seguir a contagem exata de células e os tempos de mudança média.
Omitir a mudança média mesmo um dia, ou reduzir o volume desse meio em qualquer etapa, pode causar morte celular maciça. A velocidade da cultura de balanço de corpos embrionários tem que ser cuidadosamente otimizada.
