Agradecemos a Ella Weinert, Michelle Helms e Marlis Badusche para obter assistência técnica excelente, Jessica Börstler para análises de mosquitos Culex , Norbert Becker e Björn Pluskota para o fornecimento de ovos de Aedes albopictus e Olli Vapalahti para fornecendo o estoque de vírus. ML foi apoiada pela Associação de Leibniz; conceda número Serra-2014-SGN-3.

1. prepare mosquitos fêmeas
<ol><li>Recolha os mosquitos de uma gaiola grande, usando um aspirador (aproximadamente 400 mosquitos por gaiola grande).</li>
	<li>Anestesiar os mosquitos com dióxido de carbono (CO2) para 7 s.</li>
	<li>Classificar 20 fêmeas por frasco plástico (Ø 50 mm × 100 mm). Nota: Se os mosquitos acordar, use outro 3 s de CO2.
</li>
	<li>Morrer de fome os mosquitos durante a noite.</li>
</ol>2. farinha de sangue artificial
Nota: Todas as etapas são realizadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>
Prepare a refeição de sangue infecciosa.
	<ol>
<li>Diluir o estoque de vírus na concentração de 1 x 108 placa formando unidades (PFU) / mL. Nota: A concentração das ações foi determinada através da realização de cultura de tecidos método de dose 50 infecção (TCID50) e calculada pelo Spearman & Karber algoritmo10,11.</li>
		<li>Mix expirou sangue humano (preservação de sangue) no banco de sangue (não é adequado para humano, mas é útil para mosquitos) com frutose (8% solução), filtrado de soro bovino (FBS) e solução de trabalho do estoque de vírus (expirou sangue humano: frutose: FBS: solução de trabalho = 5:3:1:1). Nota: Nós escolhemos sangue humano, porque este é o host conhecido mamífero natural de ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Congele a 140 µ l da mistura de farinha de sangue para posterior análise através de TCID50.</li>
	<li>
Realize alimentação artificial usando métodos de alimentação diferentes, dependendo da espécie:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: Use uma membrana que alimentam o sistema por 30 min (1 mL por alimentador).</li>
		<li>
Culex spp.: fornecem o sangue infeccioso através de um stick de algodão durante a noite e não aquecer o sangue (300 µ l por frasco).</li>
		<li>
Aedes albopictus: Coloque duas gotas (50 µ l cada) da mistura de farinha de sangue num frasco de plástico e deixe os mosquitos alimentar por 2 h. Não aquecer o sangue. Nota: Os mosquitos irão alimentar nos primeiro 15 min. O tempo de incubação prolongada é necessário devido a razões de segurança. As gotas de sangue são drenadas depois alimentado de 2 h, que assim, reduzir o risco de contaminação durante a triagem dos mosquitos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestesiar os mosquitos com CO2 para 7 s. Nota: Se os mosquitos acordar, use outro 3 s de CO2.</li>
	<li>Classificação e contagem totalmente ingurgitadas mosquitos dentro de um frasco de novo.</li>
	<li>Adicione uma almofada de algodão, saturada com frutose (8% solução) entre o frasco e um plug.</li>
	<li>Mantém os mosquitos à temperatura designada de 18 ° C ou a 27 ° C, na umidade de 80% para 14 ou 21 dias.</li>
	<li>Alimente os mosquitos com almofadas de algodão saturado de frutose. Reabastecer a cada 72 h com 1,5 mL de frutose (8% solução) por frasco (até 20 mosquitos, dependendo a alimentação taxa, consulte a etapa 2.5).</li>
</ol>3. forçado a salivação ensaio no dia 14 ou 21
Nota: Todas as etapas são realizadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>2 x 104 células de Vero de semente / por bem em um 96 bem placa com 200 µ l de meio de crescimento (modificado de Dulbecco´s eagle suplementado (DMEM) com 3% FBS, 100 U/mL penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 5 µ g/mL, anfotericina B, 2 mM L-glutamina 1% não aminoácidos essenciais (timina), piruvato de sódio 1%).</li>
	<li>
Prepare o dispositivo salivação:
	<ol>
<li>Coloque uma placa de vidro quadrada (20 × 20 cm) no banco em um ângulo de 30°. Nota: Isto é necessário devido a sub-pressão no laboratório de segurança. Se a placa for horizontal ou vertical, o líquido irá vazar.</li>
		<li>Coloque a fita de adesivo dupla face em cima da placa de vidro.</li>
		<li>Papel a argila de modelagem até que ela atinge um diâmetro de 0,5 cm e anexá-lo horizontalmente 1 cm a fita adesiva de dupla face.</li>
		<li>Corte o primeiro 0,3 cm da ponta de uma ponta do filtro de 10 µ l. Nota: É aconselhável preparar isto antes de iniciar o experimento fora do laboratório de biossegurança.</li>
		<li>Encha as filtro dicas com 10 µ l de soro de tampão fosfato (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Coloque as pontas de filtro sobre a argila de modelagem com a ponta em direção a fita-cola.</li>
		<li>Segura as pontas do filtro com uma pressão suave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare os mosquitos:
	<ol>
<li>Anestesia os mosquitos com CO2.</li>
		<li>Retire as pernas e as asas para imobilizar os mosquitos.</li>
		<li>Corrigi o mosquito vivos corpos sobre a fita-cola acima uma ponta do filtro.</li>
		<li>Coloque o narigudo suavemente a ponta do filtro.</li>
		<li>Execute o ensaio de salivação durante 30 min.</li>
		<li>Retire as pontas do filtro e descarte o barro e a fita.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. processamento de Saliva
Nota: Etapas 4.1 – 4.6.2 são executadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>Expulse o conteúdo para os tubos de reação contendo 10 µ l de PBS.</li>
	<li>Misture delicadamente e transfira o conteúdo para os poços da placa 96 bem preparado usando um bem por amostra.</li>
	<li>Incube a placa por 7 dias a 37 ° C com 5% de CO2.</li>
	<li>Use o binóculo para marcar as células para a presença de efeito citopático (ECP).</li>
	<li>Se o poço é positivo para o CPE, recolher o sobrenadante por pipetagem µ l 140 em um tubo de reação para a extração de RNA.</li>
	<li>
Purifica o RNA usando um kit de extração de RNA.
	<ol>
<li>Mix 140 µ l do sobrenadante com 560 µ l de AVL buffer (tampão de Lise viral) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 560 µ l de etanol (96%) e a amostra de vórtice. Nota: As amostras são inactivadas após esta etapa e podem ser descarregadas fora do laboratório BSL-3.</li>
		<li>Pipeta 630 µ l da amostra em uma coluna e centrífuga com 6.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Descartar o filtrado, pipetar os restantes µ 630 l na coluna e repetir a centrifugação.</li>
		<li>Lave o RNA, vinculado à membrana da coluna, adicionando 500 µ l de tampão 1 para a coluna e o centrifugador de lavagem a 6.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um novo tubo de coleta. Adicione 500 µ l lavagem buffer 2 e centrifugar a 12.500 x g durante 3 min.</li>
		<li>Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de reação de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de tampão de eluição e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar a 6.000 x g por 1 min e em seguida, descartar a coluna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise as amostras para o RNA ZIKV via RT-qPCR.</li>
</ol>5. processamento de corpos de Mosquito
Nota: Etapas 5.1 – 5.5 são executadas sob condições de BSL-3.
<ol><li>Retire os corpos do mosquito e coloque cada corpo em um tubo de reação. Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
	<li>Adicione 500 µ l de mídia de homogeneização (DMEM sem qualquer adendos) no tubo de reação.</li>
	<li>Homogeneizar o corpo usando batedeira motor e usar um pistilo novo para cada amostra.</li>
	<li>Adicione 200 µ l do homogeneizado em uma 96--placa para purificação. Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
	<li>Desativar a placa de incubação para 60 min a 60 ° C.</li>
	<li>Purifica o RNA pela purificação automatizado do ácido nucleico. Nota: É possível pausar o experimento neste ponto e armazenar as amostras a-80 ° C.</li>
</ol>6. análise
<ol><li>Quantificar as cópias de RNA Viral usando RT-qPCR. Nota: As cópias de RNA foram em média sobre todos os corpos de mosquito ZIKV-positivo e sem incluir os mosquitos ZIKV negativo.</li>
	<li>Calcule o IR, definido como o número de corpos de mosquito ZIKV positivo por número de fêmeas alimentadas.</li>
	<li>Calcule a TR, definida como o número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo. A taxa de transmissão não pode ser calculada para combinações de temperatura-espécies com nenhum corpo de ZIKV-positivo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus.">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li><li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+selected+African+mosquito+(Diptera:+Culicidae)+species+for+Rift+Valley+fever+virus.">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li><li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses.">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li><li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+salivation+and+virus+transmission.">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li><li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes.">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li><li>Heitmann, A., Jansen, S., L&#252;hken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe.">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li><li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).</li><li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kompendium+der+allgemeinen+Virologie.">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt f&#252;r Veterin&#228;rmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).</li><li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Anteriormente mostrou que os resultados obtidos com salivação forçada são na linha clássica de experimentos re-alimentação6. No entanto, em experimentos de re-alimentação e em nosso método apresentado de salivação forçada, é impossível diretamente a prova de atividade de salivação ou monitorar a liberação de saliva. Para provar a atividade de salivação, as amostras podem ser testadas para outros componentes presentes na saliva (ex., proteínas, carboidratos, etc.). Além disso, qPCRs adicional seria permitir a detecção de cópias de RNA virais. Isto, no entanto, requer separação de amostras de saliva para diversas análises, que podem limitar a sensibilidade no ensaio de cultura celular, em caso de números de partículas muito baixa. Por sua vez, isso pode levar a uma subestimação das taxas de transmissão de determinado.
Para obter resultados reprodutíveis, é necessário garantir que todos os mosquitos ficar vivos até o final do experimento. Isso é controlado pelo monitoramento visualmente a atividade de movimento de corpo dos mosquitos. Além disso, o uso do princípio do ensaio salivação para uma espécie de mosquito determinado tem que ser testado por vírus de controle, que são sabidos para ser transmitido por esta espécie de mosquito específico de alimentação. Vice-versa, cada vírus introduzido um experimento tem que ser testado em um mosquito suscetível.
Ensaios de salivação forçado têm muitas vantagens. Elevado número de mosquitos pode ser testado simultaneamente em um único espécime base em condições controladas e padronizadas sem entrar em conflito com normas de bem-estar dos animais9.
O método é usado por vários laboratórios. No entanto, as configurações exatas podem ser diferentes, que pode levar a diferenças nos resultados entre os laboratórios. Um componente crítico é o capilar para coletar a saliva, que pode ser feita de vidro14 ou15de plástico. Para cumprir com as normas de alta segurança de um insetário de nível 3 de segurança biológica, usamos dicas de filtro plásticas em vez de capilares de vidro, reduzindo assim o risco de lesões. Além disso, o filtro dicas tem a vantagem que o líquido coletado pode ser facilmente transferido usando uma pipeta.
A instalação do forçada salivação ensaio apresentado aqui é baseada em dois investigadores trabalhando juntos e compartilhando direitos. Desmobilização do mosquito é executada por uma pessoa, enquanto o outro simultaneamente prepara a instalação forçada de salivação. Isto reduz tempo de manuseio e minimiza o risco da amostra como mudar entre a desmobilização-local de trabalho e a salivação-placa de comutação não é necessário. Além disso, ele permite colocar os mosquitos no dispositivo de salivação forçada imediatamente após a desmobilização. Este mosquito bastante curto tempo de tratamento é essencial para o sucesso salivação forçada. Por último, os mosquitos podem ser monitorados diretamente para motilidade durante todo o experimento.
O ensaio de salivação apresentado aqui é usado para obter insights sobre o potencial vetor de espécies de mosquito. No entanto, para responder a algumas outras questões específicas (ex., os números de picadas de mosquito que são necessários para infectar os vertebrados), animal experimentos ainda podem ser necessários.

Em 2015, vírus Zika (ZIKV), um vírus transmitidas por mosquitos (mobovirus) pertencente à família Flaviviridae, surgiu na Colômbia e no Brasil e espalhou-se rapidamente através das Américas e do Caribe, causando uma epidemia com um notável número de associados casos clínicos de microcefalia e síndrome de Guillain-Barré1. Mosquitos da espécie Aedes aegypti e Aedes albopictus são considerados os vetores primários e secundários de ZIKV2, mas outras espécies do género Aedes também provaram ter competência vetorial experimental3 . Em contraste com as espécies de Aedes , maior parte das espécies de Culex testadas até agora não é capazes de transmitir o vírus4. Apenas, os dados para o Culex quinquefasciatus fornecido resultados inconclusivos3. Neste momento, informação está faltando na competência de vetor mosquito para ZIKV sob condições de temperatura moderada (< 20 ° C). No entanto, esta informação é substancial para as avaliações de risco dos spreads possíveis para regiões com clima temperado como Europa Central.
Um vetor competente para ZIKV é capaz de adquirir, manter, ampliar e finalmente transmitir o vírus. Portanto, teste o mosquito corpos, ou partes dos corpos, incluindo pernas, intestino, cabeça ou glândulas salivares, para ZIKV não é suficiente para determinar a competência vetorial. É obrigatório para testar partículas infecciosas vírus dentro saliva lançado. Para avaliar a competência vetorial, tanto a taxa de infecção (IR, número de corpos de mosquito ZIKV positivo por número de mosquitos ingurgitados) e a taxa de transmissão (TR, número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo), tem que ser determinado. IRs de mosquitos podem ser facilmente analisados pelos mosquitos simplesmente homogeneização, seguidos de uma reação em cadeia da polimerase em tempo real de transcriptase reversa (RT-qPCR) segmentação ZIKV. Além disso, a infecção pode ser ainda mais caracterizada por determinar o número de cópias virais por mosquito. Em contraste, a análise das taxas de transmissão se baseia na detecção de partículas de vírus viável na saliva de mosquitos individuais. Isto pode ser conseguido pela alimentação dos mosquitos infectados em animais suscetíveis do hospedeiro, seguidos pela análise da virémia no anfitrião5. No entanto, esse método se baseia em organismos-modelo apropriado e é caro e restrito por normas de bem-estar animal. Para evitar o uso de animais de laboratório para a análise de taxas de transmissão e reduzir os custos, artificial, sistemas de re-alimentação usar sangue gotículas tem sido descrito6. No entanto, testes em escala individual, combinada com um elevado número de indivíduos é difícil e demorado. A primeira descrição de um ensaio de salivação na escala individual foi publicada em 19667 e durante os últimos anos, experiências de salivação forçada tornaram-se o método de escolha para avaliar a competência vetorial de mosquitos3,8 .
Com base no nosso estudo de competência vetorial de Europa Central mosquitos recentemente publicado9, descrevemos salivação forçada, conforme relatado por Anderson et al. 8 , com algumas modificações. Este método permite alto rendimento padronizado experiências sob condições de biossegurança de alto nível (BSL-3) e inclui a identificação do vírus ativo pelos ensaios de cultura à base de célula. Os experimentos descritos aqui incluem 856 mosquitos. Eles foram infectados com ZIKV por refeição de sangue artificial e posteriormente analisados para a presença de partículas infecciosas vírus na saliva. Os mosquitos introduzidos dois experimentos composta por laboratório há muito estabelecidas populações de Ae. aegypti e Culex pipiens pipiens biótipo molestus (Cx. p. molestus), bem como campo pego Culex pipiens pipiens biótipo pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) e duas populações de Ae. albopictus . Com exceção de uma das duas populações Ae. albopictus , que foi recolhida na Itália, todos os mosquitos foram coletados na Alemanha.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inject+matic Sleeper</td>
			<td>Inject+matic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td>
			<td>BugDorm Store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK11.2</td>
			<td>plastic vial for mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug for drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK15.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant climate chamber</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KBF-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont-Pincette Electronic SS</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>B40c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>BNITM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flash light aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td>
			<td>Ansell</td>
			<td></td>
			<td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td>
			<td>altona diagnostics</td>
			<td>591013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>4462359</td>
			<td>RNA isolation of mosquito bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td>RNA-Isolation of supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips (20 &#181;L)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>701,116,210</td>
			<td>Cut the first 3 mm of the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>sold out</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro pestles for hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>CXH8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td>P0403550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P06-0110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>4981.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0443100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NAA</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0832100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek Feeder</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler Software</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 SW 1.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King Fisher Flex Purification System</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes albopictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular light</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>MLC-150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

Competência de vetor é definida como o potencial de uma espécie de mosquito para transmitir um vírus transmitidas por mosquitos (mobovirus) para um hospedeiro vertebrado. Partículas de vírus viáveis são transmitidas durante uma refeição de sangue através da saliva de um mosquito infectado. Ensaios de salivação forçada permitem determinar o potencial de vetor com base único mosquitos, evitando o uso de experiências com animais. O método é adequado para analisar um grande número de mosquitos em um experimento dentro de um curto período de tempo. Ensaios de salivação forçado foram usados para analisar 856 mosquitos individuais presos na Alemanha, incluindo dois diferentes biótipos de Culex pipiens pipiens , Culex torrentium , bem como Aedes albopictus, que foram infectados experimentalmente com vírus Zika (ZIKV) e incubados a 18 ° C ou 27 ° C, para duas e três semanas. Os resultados indicaram a falta de competência vetorial dos diferentes táxons Culex para ZIKV. Em contraste, o Aedes albopictus foi suscetível a ZIKV, mas apenas a 27 ° C, com taxas de transmissão semelhantes a uma colônia de laboratório Aedes aegypti testada em paralelo.

Aedes aegypti é conhecido como um vetor competente para ZIKV pelo menos sob condições climáticas tropicais12. Portanto, usamos Ae. aegypti como um controle positivo para estabelecer o ensaio e analisar a receita federal, bem como TRs em uma temperatura de incubação de 27 ° C e uma humidade de 80%. IR e TR... foram definidos conforme descrito por Fortuna et al. 13. desafiado Ae. aegypti mostrou IR de 50% e 72% e TR de 42% e 31% em 14 e 21 dias pós infecção (dpi), respectivamente (figura 1A e 1B). Posteriormente, mosquitos europeus foram testados para infecção ZIKV e transmissão usando condições climáticas tropicais, bem como temperadas.
A temperatura de incubação de 27 ° C, todas as espécies de mosquito mostraram infecção ZIKV 14 dpi, bem como 21 dpi, exceto Cx. pipiens p. e Cx. torrentium indivíduos, que foram positivos em 14 dpi apenas. Todas as espécies de Aedes mostraram maior IRs (entre 50% e 72%) bem como a maior concentração de RNA viral (106 até 10 amostras de9 RNA cópias/mosquito) em comparação com os diferentes táxons de Culex , que revelou o IRs que variam entre 0 % e 32% e cargas virais de 103 a 10 espécimes de cópias/mosquito4 RNA. Todas as espécies de Aedes exibido saliva ZIKV-positivo (TR 13 – 42%), Considerando que nenhuma das amostras de saliva de táxons o Culex contido ZIKV (figura 1A e 1B). Curiosamente, as taxas de transmissão em dpi 21 foram semelhantes nos Ae. aegypti e albopictus Ae... da Alemanha (30%), mas foram substancialmente menores em Ae. albopictus da Itália (13%).
Incubação de mosquitos desafiados a uma temperatura moderada de 18 ° C revelado geralmente baixa vírus carrega na espécie Aedes (4– 10 106 RNA cópias/mosquito), bem como dos diferentes táxons Culex (102-104 Cópias de RNA/mosquito). No entanto, a 18 ° C temperatura de incubação, transmissão de ZIKV não foi observada para qualquer das espécies de mosquito investigadas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Figura 1: taxas de transmissão de mosquitos infectados experimentalmente com ZIKV. Resultados de estudos de competência vetorial com ZIKV em espécies diferentes de mosquitos. Seis táxons diferentes mosquito foram infectados com ZIKV e incubados a 27 ° C ou ° C 18 para 14 (A) ou 21 dias (B). TR é definido como o número de mosquitos com saliva ZIKV positivo por número de corpos de mosquito ZIKV-positivo. O número total de mosquitos investigado foi 856, com um mínimo de 30 indivíduos por táxons de ponto/temperatura/mosquito cada vez. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

Controlo eficaz de transmissão do vírus a cargo de mosquito, o conhecimento do potencial vetor de respectivos mosquitos é de particular interesse. Descrevemos a salivação forçada como um método para analisar a competência vetorial do Aedes albopictus e três táxons de Culex diferentes para a transmissão de vírus Zika.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K visualizações.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. Controlo eficaz de transmissão do vírus a cargo de mosquito, o conhecimento do potencial vetor de respectivos mosquitos é de particular interesse. Descrevemos a salivação forçada como um método para analisar a competência vetorial do Aedes albopictus e três táxons de Culex diferentes para a transmissão de vírus Zika.

Vídeo: Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

Uma injeção de. Embriões stephensi para gerar malária resistente a mosquitos

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Biologia

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

Uso de Rotorod como um método de análise qualitativa de Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable production of mosquitoes is currently inhibited by the supply of fresh vertebrate blood. Alternatives to blood are required to promote efficient control strategies for malaria and other vector borne diseases that are transmitted by blood feeding insects. With this in mind, artificial liquid diets were formulated as substitutes for fresh vertebrate blood. Herein we report a blood-free artificial liquid diet that delivers feeding rates similar to blood and mimics the physiological effects of a fresh vertebrate blood meal. The diet induces ovarian and egg maturation of Anopheles mosquitoes and also produces good larval survival and development of functional adults. The formulated blood-free liquid diet is an important advance towards sustainable mosquito breeding in captivity and will reduce the maintenance costs of mosquito colonies and eliminate the need for fresh vertebrate blood.

A protocol is presented for formulation of a blood-free artificial diet to feed Anopheles mosquitoes in captivity. This diet has a similar performance to vertebrate blood and triggers oogenesis and egg maturation and produces viable adult progeny.

Uma dieta sem sangue para mosquitos de anophelina traseira

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Crescimento glomerular como um ensaio ex vivo para analisar caminhos envolvidos na ativação de células epiteliais parietal

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...