Agradecemos a Anne Dodson e Stephanie Heinrich para aconselhamento sobre como otimizar o protocolo smFISH, Xavier Darzacq para ajudar com a plataforma de análise, Haiyan Huang para sugestões sobre a análise estatística. Este trabalho foi financiado por fundos da March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) e Glenn Foundation para EÜ e um NSF pós-graduação Research Fellowship Grant no. DGE-1106400 de JC.

Nota: Todos os buffers e os suportes utilizados neste protocolo são listados na tabela 1. As informações do fornecedor para os reagentes são listadas na Tabela de materiais.
Dia 1/dia 1-2:
Nota: Para a cultura vegetativa, desenvolvem-se células para uma OD600 de 0,4 a 0,6 em meio preferencial. Para cultura meiótica, induzi células submeter-se a meiose, usando um método preferido (normalmente cultivo em uma OD600 de 1,85).
1. fixação e digestão da amostra
<ol><li>Conserte um total de ~3.5 OD600 de células em formol 3%.<ol>
<li>Para cultura vegetativa, adicione 5,52 mL da cultura a 480 µ l de formol de 37% em tubos cônicos de 15 mL.</li>
		<li>Para cultura meiótica, adicione 1840 µ l de cultura a 160 µ l de formol de 37% em 2 mL microcentrifuge tubos. Inverter ~ 5 vezes para misturar. Atenção: O formol é tóxico. Manuseie e elimine de acordo com regulamentos institucionais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os tubos em um tambor de cilindro em temperatura ambiente por 20 min. Para amostras meióticas, após a fixação em temperatura ambiente por 20 min, continuam durante a noite de fixação no 4 ˚ c, rotação. Nota: A fixação durante a noite aumenta a reprodutibilidade e a qualidade dos dados smFISH obtidos para as amostras meióticas. Tempo de fixação deve ser otimizado.</li>
	<li>Enquanto as amostras estiver corrigindo, descongele 200mm vanadil Ribonucleoside complexos (VRC) em 65 ˚ c durante pelo menos 10 minutos.</li>
	<li>Preparar a mistura de mestre digestão em um tubo de 15 mL: para 1 amostra, misturar 425 µ l de tampão B com 40 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c); para 5 amostras, misture 2125 µ l de tampão B com 200 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c). Vórtice ~ 5 s para totalmente resuspenda o VRC antes de adicionar à mistura de mestre, que irá aparecer a luz verde acastanhado após adição da VRC. Nota: Adição de VRC durante a digestão melhora a consistência dos resultados smFISH, potencialmente, inibindo o contaminante de nuclease introduzido pela mistura de zymolyase, que é purificada do extrato bruto. A quantidade de VRC necessário a esta etapa deve ser otimizada.</li>
	<li>Para amostras vegetativas, centrifuga os tubos no ~ 1057 x g durante 3 minutos. Para amostras meióticas (após a fixação da noite), centrifugar a 21.000 x g, durante 1,5 min. decantar ou aspirar o sobrenadante para resíduos de formaldeído. Nota: Todas as etapas de centrifugação são realizadas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de frio Buffer B pipetando para cima e para baixo ou invertendo os tubos e passando rapidamente para misturar. Transferi amostras vegetativas para tubos de 2 mL após ressuspensão.</li>
	<li>Centrifugue a 21.000 x g 1,5 min. remover a maior parte do líquido por aspiração vácuo ou pipetando, deixando para trás ~ 100 µ l.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de frio B. Buffer</li>
	<li>Centrifugue a 21.000 x g 1,5 min. remover a maior parte do líquido por aspiração vácuo ou pipetando, deixando para trás ~ 100 µ l.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de frio Buffer B. Centrifugue a 21.000 x g 1,5 min. aspirado o líquido completamente por vácuo ou pipetando.</li>
	<li>Ressuspender as células em 425 µ l de mistura de mestre de digestão e brevemente vórtice para ressuspender. Adicione 5 µ l de zymolyase de 10 mg/mL de 100T a cada tubo. Nota: Vórtice a zymolyase toda vez antes de adicionar aos tubos. Zymolyase adicione a cada tubo individualmente, em vez de adicionar à mistura de mestre. Ambas as etapas ajudam a manter a consistência de digestão entre os tubos, porque zymolyase precipita-se rapidamente.</li>
	<li>Vórtice de 2-3 s para misturar. Coloque os tubos em um tambor de cilindro e digerir a 30 ˚ c durante 15-30 min. Para as células vegetativas e primeiros estágios meióticos, normalmente demora ~ 15 min, e para prófase meiótica e divisões meióticas, normalmente demora ~ 30 min. Nota: Verifique no microscópio cada 5 min depois de 15 min e parar a digestão quando aparecem de ~ 80% das células não-transparente e não-refrativa. De agora em diante, as células são muito frágeis. Lidar com células suavemente e evitar o uso de vácuo aspiração ou num Vortex.
</li>
	<li>Centrifuga os tubos no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o líquido completamente pipetando.</li>
	<li>Resuspenda suavemente células com 1 mL de tampão B pipetando acima e para baixo 1 - 2 vezes para misturar.</li>
	<li>Centrifuga os tubos a ~ 376 x g durante 3 min. líquido de remover o tampão B pipetando. Delicadamente Ressuspender as células em 1 mL de etanol a 70% (diluído com água livre de RNase).</li>
	<li>Incube a temperatura ambiente para 3,5-4 horas.</li>
</ol>2. hibridação
<ol><li>Levar o formamide à temperatura (para alíquota de 50 mL, leva ~ 30 min em banho-maria). Nota: Não abra a garrafa de formamida até a garrafa atinja a temperatura ambiente para evitar a oxidação de formamida. Cuidado: Formamida é tóxica. Manuseie e elimine de acordo com regulamentos institucionais.</li>
	<li>Prepare o tampão de lavagem de formamida 10% em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuga os tubos no ~ 376 x g durante 3 min. remover 500 µ l de etanol 70% por pipetagem. Suavemente a pipeta acima e para baixo para Ressuspender as células restantes e então transferir as células para tubos de baixa aderência. Nota: Utilizando tubos de baixa aderência grandemente reduz a perda de células durante lavagens subsequentes.</li>
	<li>Centrifuga os tubos novamente a ~ 376 x g durante 3 min. remover todo o etanol pipetando.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de tampão de lavagem de formamida 10% e suavemente pipeta acima e para baixo, 2 - 3 vezes para Ressuspender as células.</li>
	<li>Permitir que as células para sentar-se à temperatura ambiente por ~ 20 min enquanto se prepara a solução de hibridação. Para 1 amostra, misture 50 µ l de tampão de hibridização (sala temp.), 5 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c) e 1 µ l de cada sonda (final de 200 nM). Para 5 amostras, misture 250 µ l de tampão de hibridização (sala temp.), 25 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c) e 5 µ l de cada sonda (final de 200 nM).<ol>
<li>Descongele o tampão de hibridização (congelado a-20 ˚ c) à temperatura ambiente antes de abrir o tubo para evitar a oxidação de formamida.</li>
		<li>Depois de adicionar a 200mm VRC, vórtice para 5-10 s antes de adicionar as sondas, que são projetados adquiridos comercialmente e reconstituído de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Se duas sondas são incubadas co, adicione 1 µ l da 01:10 diluição do estoque a sonda #1, bem como 1 µ l da 01:10 diluição da unidade populacional de sonda #2, tornar-se uma diluição final de ~ 1: 500 para cada sonda. A concentração necessária para o melhor sinal-para-ruído precisa ser otimizado (ver discussão para detalhes).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar as amostras no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante em resíduos perigosos pipetando.</li>
	<li>Adicione pelo menos 50 µ l de solução de hibridização de cada tubo. Agite os tubos para misturar.</li>
	<li>Incube a 30 ˚ c em um tambor de cilindro pelo menos 16 horas no escuro.</li>
</ol>Dia 2/dia 3
3. lavar e imagem
<ol><li>Levar o formamide à temperatura.</li>
	<li>Prepare-se 10% formamida o tampão de lavagem (FWB) em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Retirar os tubos do tambor de rolo e coloque-os em uma caixa de folha-cobertas para proteger da luz.</li>
	<li>Centrifugar as amostras no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante em resíduos perigosos pipetando.</li>
	<li>Resuspenda em 1 mL de 10% FWB suavemente pipetando acima e para baixo 2 - 3 vezes.</li>
	<li>Incube a 30 ˚ c por 30 min (não rotativos) na caixa de folha-cobertas.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a ~ 376 x g por 3 min. Retire o sobrenadante para resíduos perigosos por pipetagem e deixar ~ 50 µ l.</li>
	<li>Enquanto isso, preparar DAPI/FWB em um tubo cônico de 15 mL: para 1 amostra, misturar 1000 µ l de tampão de lavagem de formamida 10% com 1 µ l de 5mg/mL DAPI. Para 10 amostras, misture 10 mL de tampão de lavagem formamide 10% com 10 µ l de 5mg/mL DAPI. Resuspenda em 1 mL de DAPI/FWB suavemente pipetando acima e para baixo 2 - 3 vezes.</li>
	<li>Incube a 30 ˚ c por 30 min (não rotativos) na caixa de folha-cobertas.</li>
	<li>Descongele os reagentes antilixívia no gelo.</li>
	<li>Centrifugar as amostras no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante completamente pipetando. Se necessário, centrifugue novamente para remover todo o sobrenadante.</li>
	<li>Para as amostras que não são imagem imediatamente, resuspenda o pellet em 50 µ l de Buffer GLOX sem enzimas. Pipeta acima e para baixo 3 - 4 vezes para misturar.<ol>
<li>Mantenha todas as amostras unimaged na caixa folha-cobertas no 4 ˚ c até que esteja pronto a imagem. Quando estiver pronto para a imagem, Centrifugar as amostras a ~ 376 x g por 2 min e retire o sobrenadante completamente por pipetagem. Resuspenda em GLOX com enzimas como abaixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para amostras sendo fotografada imediatamente, adicionar 15 a 20 µ l de tampão GLOX com enzimas. Suavemente a pipeta para cima e para baixo se misturam. Nota: O volume adicionado pode variar dependendo do tamanho do centrifugado. Recomendamos que resuspending a pelota em 15 µ l de tampão GLOX com enzimas e verificar a densidade de células em microscópio. Se são demasiado densas (células aglutinação uns sobre os outros), adiciona extra reserva GLOX com enzimas. Se as células são muito escassas, centrifugar a amostra e remover ~ 5 µ l de tampão.</li>
	<li>Pipetar 5 µ l para uma lamela (18 x 18, n. º 1) e colocar a lamela em um slide.</li>
	<li>Coloca uma limpeza de laboratório em cima do slide onde a lamela é colocada. Pressione suavemente sobre a limpeza de laboratório para definir o slide (deve ver líquido saindo de todas as quatro bordas da lamela).</li>
	<li>Transferi o slide para o quarto de microscópio em uma caixa coberta por papel alumínio.</li>
	<li>Imagem usando um microscópio de fluorescência de campo amplo com alta ampliação (60-100x) e alta abertura numérica. Observação: Para coletar o número máximo de fótons emitidos por sondas smFISH, microscópios confocal não são recomendados, como eles limitam significativamente a quantidade de luz a serem coletados. Aqui, os dados foram coletados em um microscópio equipado com 100 X, objectivo de at 1.4, usando filtros CY5 (EX632/22, EM679/34) fotografada em 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; e DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, T. 32-50% Uma imagem brilhante-campo referência também deve ser adquirida. Adquirir 15-25 fatias com um tamanho de passo de 0,1-0,2 µm, de inteiramente abaixo o foco do campo de visão inteiramente acima, a fim de garantir que todos os pontos do RNA são contabilizados.</li>
</ol>4. análise de imagens
<ol><li>Analise os dados de smFISH com ferramentas de análise de smFISH publicado como peixe-quant17 e plateia2ou com programas feitos sob medidos, conforme as suas necessidades exatas do experimento. Nota: Um pipeline de boa análise deve permitir que os usuários determinar um limite para separar os verdadeiros pontos de RNA do fundo e estatísticas, tais como as coordenadas X, Y e Z (opcionais) e a intensidade de cada ponto, o número de pontos em cada célula de saída e possivelmente montagem parâmetros como uma maneira de filtrar as detecções falsas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Rahman, S., Zenklusen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+(smFISH)+in+the+yeast+S.+cerevisiae.">Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).</li><li>Gaspar, I., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+in+numbers:+quantitative+single-molecule+RNA+detection+assays.">Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).</li><li>Vargas, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+transcriptionally+coupled+and+uncoupled+splicing.">Single-molecule imaging of transcriptionally coupled and uncoupled splicing.</a> Cell. 147 (5), 1054-1065 (2011).</li><li>Waks, Z., Klein, A. M., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+variability+of+alternative+RNA+splicing.">Cell-to-cell variability of alternative RNA splicing.</a> Mol Syst Biol. 7, 506 (2011).</li><li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast.">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li><li>Senecal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+modulate+c-Fos+transcriptional+bursts.">Transcription factors modulate c-Fos transcriptional bursts.</a> Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).</li><li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells.">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Methods. 10 (9), 865-867 (2013).</li><li>Hansen, C. H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+type+switching+in+yeast+controlled+by+asymmetric+localization+of+ASH1+mRNA.">Mating type switching in yeast controlled by asymmetric localization of ASH1 mRNA.</a> Science. 277 (5324), 383-387 (1997).</li><li>Park, H. Y., Trcek, T., Wells, A. L., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+analysis+method+to+quantify+mRNA+localization+reveals+its+correlation+with+cell+motility.">An unbiased analysis method to quantify mRNA localization reveals its correlation with cell motility.</a> Cell Rep. 1 (2), 179-184 (2012).</li><li>Jourdren, L., Delaveau, T., Marquenet, E., Jacq, C., Garcia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CORSEN,+a+new+software+dedicated+to+microscope-based+3D+distance+measurements:+mRNA-mitochondria+distance,+from+single-cell+to+population+analyses.">CORSEN, a new software dedicated to microscope-based 3D distance measurements: mRNA-mitochondria distance, from single-cell to population analyses.</a> RNA. 16 (7), 1301-1307 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+inactivation+by+expression+of+a+repressive+mRNA.">Kinetochore inactivation by expression of a repressive mRNA.</a> eLife. 6, e27417 (2017).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nat Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Brar, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+view+of+the+yeast+meiotic+program+revealed+by+ribosome+profiling.">High-resolution view of the yeast meiotic program revealed by ribosome profiling.</a> Science. 335 (6068), 552-557 (2012).</li><li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin.">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li><li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2.">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes Dev. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li><li>Dodson, A. E., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+capture+of+heterochromatin+dynamics+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heritable capture of heterochromatin dynamics in Saccharomyces cerevisiae.</a> eLife. 4, e05007 (2015).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat Protoc. 7 (2), 408-419 (2012).</li><li>Youk, H., Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+mRNA+molecules+in+yeast.">Imaging single mRNA molecules in yeast.</a> Methods Enzymol. 470, 429-446 (2010).</li></ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

O protocolo aqui apresentado é derivado de outros publicados smFISH protocolos2,3,21,22,23e é especificamente otimizado para o fundo de cepa de levedura SK1. Os parâmetros otimizados incluíam o número do celular, duração de fixação, velocidade de centrifugação e duração, duração da digestão, tampão de digestão, concentração de sonda e tampão de hibridização. Outros parâmetros como temperatura de hibridização e duração não foram otimizados. Nesta seção, nós compartilhamos algumas notas que ajudam a se adaptar a este protocolo para qualquer fundo de cepa de levedura e as condições de crescimento de interesse.
Parede celular de leveduras brotamento é um grande desafio contra a obtenção de imagens de alta qualidade smFISH em brotamento fermento porque a parede celular impede a penetração da sonda. Digestão incompleta da parede celular por zymolyase leva a ineficiente hibridização de sondas e alta variabilidade de célula para célula no sinal. No entanto, digestão excesso pode tornar as células muito frágil, levando a significativa perda de células durante as etapas de lavagem e estourando durante a preparação de slides para a imagem latente da pilha. Assim, otimizando a duração da digestão é crucial. Recomendamos a realização de um experimento piloto smFISH digerindo a mesma amostra para diferentes quantidades de tempo. No nosso caso, obtivemos os dados smFISH melhores se nós paramos a digestão quando tornou-se ~ 80% das células não-refrativa. Normalmente, para a mesma condição de crescimento diferentes cepas mutantes genéticas podem ser digeridas com sincronismo semelhante. No entanto, a duração da digestão diferente quando comparada entre as condições de crescimento diferentes e diferentes estágios da meiose em leveduras brotamento. Uma vez que o calendário é determinado, a qualidade do smFISH é reproduzível. Nota que para cepas mutantes de síntese da parede de celular com defeito e/ou composição, a digestão pode ser concluída em menos de 15 min. utilização de diferentes lotes de zymolyase também ligeiramente pode mudar o tempo de digestão.
Concentração de sonda ideal é necessária para alcançar uma alta relação sinal-ruído. Projetamos e comprou nossas sondas smFISH comercialmente. Boas sondas (geralmente 20-mers) devem ter uma porcentagem de GC variando de 35% a 45%, um espaçamento mínimo de 2 pares de base entre as sondas e baixa reatividade cruzada. Usamos um designer sonda baseado na web do fabricante para gerar uma lista de pontas de prova, e se houvesse suficiente sondas para escolher, nós usaríamos o algoritmo de explosão no banco de dados do genoma de Saccharomyces para eliminar as sondas com mais de 17 pares de base sobrepostos com outras regiões genômicas. Escolhemos a mais fotoestável tintura fluorescente (CAL Fluor 590) para o conjunto de sonda anneals para a região única de NDC80luti (CF. 590), porque neste conjunto, o número de testes que satisfeitos todos os critérios acima (20 testes) foi menor do que o número mínimo recomendado pelo fabricante (~ 25 sondas). Após reconstituir a solução de sonda, seguindo as instruções do fabricante, nós fizemos um 01:10 diluição da solução estoque e armazenados a solução diluída em alíquotas de 5 µ l em-20 ˚ c. Cada alíquota foi usada apenas uma vez. Para a otimização, um deve fazer serial diluições das 01:10 diluído solução e teste a concentração que produz a melhor relação sinal-ruído. Recomendamos fazer uma série de diluição de 1: 250, 1: 500, 1: 1000 e 1: 2000 do estoque original. No nosso caso, um fator de diluição 1: 500 resultou na melhor relação sinal-ruído, para ambos os 590 CF e 670 Q conjuntos de sonda.
Tempo de fixação ideal também é fundamental para o sucesso smFISH em leveduras brotamento. Temos encontrado que a fixação da noite no 4 ˚ c, ao invés de fixação à temperatura ambiente por 20 min, melhorou significativamente a consistência e a qualidade dos resultados smFISH para amostras meióticas. Embora nós não testamos como durante a noite fixação pode impactar amostras vegetativas, fixação à temperatura funcionou bem para esta condição de crescimento. Assim, para otimizar o protocolo smFISH para novas cepas ou condições de crescimento, recomendamos começar com tempo curto fixação à temperatura ambiente e aumentar o tempo de fixação se alta variabilidade do sinal é encontrada.
Em comparação com outros protocolos publicados3,22,23, nosso protocolo usa o inibidor de RNase VRC durante a digestão e uma maior concentração de VRC durante a hibridação. Adição de VRC nessas duas etapas melhorou a consistência dos resultados smFISH, possivelmente por melhor preservar as moléculas do RNA contra a atividade de nuclease, que podem ser introduzidos pela mistura de zymolyase (a enzima é purificada a partir de extratos brutos e pode conter RNase contaminantes). Assim, nós recomendamos usar a quantidade de VRC, conforme listado no nosso protocolo ou mesmo umas concentrações mais elevadas de VRC para otimização.
Uma parcela significativa das células pode ser perdida durante as etapas de lavagem em tampão B e o tampão de lavagem de formamida. Para reduzir a perda de células, pode-se aumentar a velocidade de centrifugação. No nosso caso, usando uma velocidade alta (21.000 x g) para nossas amostras de pelotas durante o Buffer B lava perda celular significativamente reduzida. No entanto, células tornam-se muito frágil após a digestão de zymolyase, portanto não é recomendado alterar a velocidade de centrifugação. Em vez disso, nós sugerimos o uso dos tubos de baixa aderência na Scientific EUA, que ajudam muito as células de pelotas durante as lavagens no tampão de lavagem de formamida. No geral, nosso protocolo pode gerar consistentemente uma monocamada de células densas o bastante para a imagem latente eficiente. Normalmente, 7 campos de vista deve render > 130 células apropriadas para quantificação.
Por último, é importante determinar os parâmetros ideais para e as saídas necessárias de análise de imagem. Para detectar manchas de smFISH, programas de análise publicada comumente filtram as imagens raw usando o kernel gaussiano para remover o sinal de fundo e perguntar aos usuários para determinar a relação sinal-ruído para usar para cada conjunto de imagens de2,17. Infelizmente, não há atualmente um único padrão pelo qual são determinados os parâmetros adequados, e então alguns testes empíricos dessas diferentes configurações é necessário. Para definir os parâmetros necessários para cada um destes passos, um precisa iterativamente diferentes conjuntos de parâmetros de entrada e verificar o quanto os resultados obtidos de cada conjunto corresponde da contagem manual em algumas células representativas. Uma vez que encontra-se um conjunto de parâmetros, pode ser usada para a maioria das imagens obtidas apesar das condições de crescimento diferente e origens genéticas.
Além disso, um pode testar se a projeção de intensidade máxima das imagens smFISH pode ser realizada antes da quantificação22. Este passo simplifica o algoritmo de detecção local e reduz significativamente o tempo de geração de imagens, embora à custa de algumas informações potencialmente úteis sobre pontos individuais, tais como sua localização subcellular. No nosso caso, o número de moléculas de mRNA produzido pelo gene NDC80 foi baixo o suficiente para que as manchas eram bem separadas após esse processamento (não é incomum para as transcrições em brotamento fermento3,7). Em casos onde o colocalization análise é crítico, o pipeline de análise precisa determinar a localização de cada ponto de smFISH em cada canal para avaliar colocalization. Dependendo as perguntas específicas sendo perguntado, outras informações como a intensidade de cada ponto também podem precisar de ser extraído o pipeline para posterior análise. Otimizando a chave entra o protocolo e o pipeline de análise de imagem é crucial na obtenção de alta qualidade de dados smFISH para estudar a questão de interesse.

Dinâmica regulação da expressão genética impulsiona o desenvolvimento de um organismo, bem como a sua resposta ao estresse ambiental, infecção e alterações no metabolismo. Estudos que se concentram no Regulamento transcriptional dependem de tecnologias que medem a abundância de RNA. Um tal método, denominado única molécula fluorescência em situ da hibridação (smFISH), é utilizado para detecção de moléculas individuais de RNA em células únicas1,2. Esse método permite que a medição da variabilidade na expressão gênica celular para celular e determinação da localização intracelular de RNA.
A técnica mais comumente usados smFISH, a detecção de uma molécula de RNA individual exige vários curtas sondas de DNA (frequentemente ~ 48 20-mer sondas) que são complementares ao RNA alvo e são conjugadas para a mesma tintura fluorescente. Ligação de uma única sonda fluorescente resulta num sinal fraco, mas o sinal do conjunto de todas as sondas é robusto. Esse recurso melhora a relação sinal-ruído porque mesmo que um único teste pode apresentar vinculação fora do alvo, tal sinal deverá ser muito fraco em relação ao que o destino de molécula de RNA3. No erro de deteção, o número de moléculas de RNA pode ser contado e comparado através de várias condições de crescimento e entre diferentes mutantes.
Desde seu primeiro desenvolvimento, foi adaptada para estudar vários aspectos da expressão gene4, tais como a transcrição alongamento1,2, emenda5,6, transcriptional estourando7 smFISH , 8 , 9, expressão alélica intracelular de11,10,12e RNA localização13,14,15. Recentemente, nós usamos este método para estudar a expressão de duas isoformas de transcrição do gene da mesma, em que a isoforma de transcrição curta (NDC80ORF) tem sua sequência toda compartilhada com o isoform longo (NDC80luti )16. Para identificar com exclusividade as duas isoformas de mRNA, usamos dois conjuntos de sonda: um conjunto é específico para a sequência única de NDC80luti, e o outro conjunto, conjugado com outra tintura fluorescente, vincula-se à região comum das duas isoformas. O NDC80luti RNA é identificado como um ponto colocalized com ambos os sinais fluorescentes, Considerando que o NDC80ORF RNA é aquele que contém apenas o sinal do conjunto de sonda comum. Desde o número da NDC80ORF transcrições é calculado por um método de "subtração", alta eficiência de hibridização da sonda e uma alta relação sinal-ruído são necessários com confiança identificar pontos smFISH e reduzir o erro propagação.
Este artigo descreve um protocolo otimizado para executar smFISH no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. No presente protocolo, o número do celular, tempo de fixação, tempo de digestão, tampão de digestão, sonda concentração e hibridação buffer usado para os experimentos de smFISH foram otimizados para o SK1 estirpe fundo de S. cerevisiae em fase vegetativo crescimento ou meiose. No entanto, constatamos também neste manuscrito: (1) o método para verificar a qualidade dos dados de smFISH após a aquisição da imagem e (2) os passos no protocolo que podem exigir a otimização adicional para a tensão de diferentes origens e condições de crescimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:881px;" width="881">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM2616</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Catalase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">C3515</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C for short-term. Vortex before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">D9564</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C after reconstitution in water. Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">50% Dextran Sulfate</td>
			<td style="width:99px;">Milli Pore</td>
			<td style="width:87px;">S4030</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">E. coli tRNA</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">R4251</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Ethanol (100%, 200 proof)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Flammable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">37% Formaldehyde</td>
			<td style="width:99px;">Fisher</td>
			<td>F79-500</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:205px;">Formamide</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9342</td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at 4 &#176;C after dissolving in nuclease-free water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Glucose oxidase</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">G2133</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9932</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Probe library, diluted in TE, pH 8.0&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Biosearch Technologies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots (5 &#181;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Sorbitol</td>
			<td style="width:99px;">various</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:205px;">20X SSC</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9763</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:205px;">TE, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9849</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:205px;">1 M Tris, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">Ambion</td>
			<td style="width:87px;">AM9856</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:205px;">Trolox</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:87px;">238813</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td>
			<td style="width:99px;">NEB</td>
			<td style="width:87px;">S1402S</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:205px;">Zymolyase 100T</td>
			<td style="width:99px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:87px;">08320932</td>
			<td style="width:491px;">Store at -20 &#176;C in aliquots after reconstitution in water.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:205px;">Low-adhesion tubes</td>
			<td style="width:99px;">USA Scientific</td>
			<td>1415-2600</td>
			<td style="width:491px;">Store at room temperature.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Única molécula fluorescência situ hibridação in (smFISH) é uma técnica poderosa para estudar a expressão gênica em células únicas devido à sua capacidade de detectar e contar as moléculas de RNA individuais. Complementares aos métodos baseados em sequenciamento profundos, smFISH fornece informações sobre a variação de célula para célula em abundância de transcrição e a Localização subcellular de um determinado RNA. Recentemente, temos usado smFISH para estudar a expressão do gene NDC80 durante a meiose em leveduras brotamento, na qual dois transcrição isoformas existem e a isoforma de transcrição curta tem sua sequência toda compartilhada com o isoform longo. Para identificar com confiança cada isoforma de transcrição, nós otimizadas conhecidos smFISH protocolos e obteve alta consistência e qualidade dos dados de smFISH para as amostras adquiridas durante a brotação fermento meiose. Aqui, descrevemos este protocolo otimizado, os critérios que usamos para determinar se é obtida a alta qualidade dos dados de smFISH e algumas dicas para a aplicação do presente protocolo em outras cepas de leveduras e condições de crescimento.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Esta molécula fluorescência em situ da hibridação protocolo é otimizado para quantificar o número de moléculas de RNA em leveduras brotamento durante a meiose e crescimento vegetativo.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.1K visualizações.  University of California, Berkeley. Esta molécula fluorescência em situ da hibridação protocolo é otimizado para quantificar o número de moléculas de RNA em leveduras brotamento durante a meiose e crescimento vegetativo.

Vídeo: Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Genética

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Visadas<em&gt; In Situ</em&gt; mutagénese de histona Genes em brotamento Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live cells. The DDR to helix distorting covalent DNA modifications, including interstrand DNA crosslinks (ICLs), is not as well defined. We have studied the DDR stimulated by ICLs, localized by laser photoactivation of immunotagged psoralens, in the nuclei of live cells. In order to address fundamental questions about adduct distribution and replication fork encounters, we combined laser localization with two other technologies. DNA fibers are often used to display the progress of replication forks by immunofluorescence of nucleoside analogues incorporated during short pulses. Immunoquantum dots have been widely employed for single molecule imaging. In the new approach, DNA fibers from cells carrying laser localized ICLs are spread onto microscope slides. The tagged ICLs are displayed with immunoquantum dots and the inter-lesion distances determined. Replication fork collisions with ICLs can be visualized and different encounter patterns identified and quantitated.

Lasers are frequently used in studies of the cellular response to DNA damage. However, they generate lesions whose spacing, frequency, and collisions with replication forks are rarely characterized. Here, we describe an approach that enables the determination of these parameters with laser localized interstrand crosslinks.

Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.