Estamos gratos a Karin Winterhalter e Kerstin Semmler para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo cluster de excelência BrainLinks - BrainTools (EXC. 1086), da Fundação de pesquisa alemã.

Todos os métodos que envolvam animais vivos foram aprovados pelo Regierungspräsidium Freiburg em conformidade com o alemão Animal Welfare Act.
1. preparações
<ol><li>Projetar e construir uma ferramenta de inserção adequada, transitoriamente, carregando a sonda de silicone e o conector do eletrodo durante o processo de implantação. Veja a Figura 1 para uma ferramenta de inserção construído personalizado de exemplo.</li>
	<li>Solte cuidadosamente o conector de sonda e eletrodo de silicone da embalagem usando pinça com ponta de cerâmica.</li>
	<li>Levante a placa de ligação e corrigi-lo firmemente com uma pinça de crocodilo anexada a um carrinho.</li>
	<li>Usando um estereoscópio, alinhe a sonda com a ferramenta de inserção com a pinça com ponta de cerâmica. Aplica uma camada de cera de parafina derretida com um cauterizador para colar a sonda para a ferramenta de inserção ~ 2 mm. Tome cuidado para não tocar as canelas de sonda durante este procedimento.</li>
	<li>Conserte o conector no eixo da ferramenta inserção usando fita adesiva padrão de eletrodo. Note que dependendo do fabricante, fios de terra talvez precisem ser soldado à placa de ligação de eletrodo, antes da implantação. Remova o isolamento de duas peças curtas de fio de cobre isolado de verniz usando solda estanho aplicada com um ferro de solda (400 ° C). Solde os fios do chão para os apropriado slots na placa de ligação do eletrodo.</li>
	<li>Remova o isolamento de duas peças adicionais de fio de cobre. Enrole cada fio de cobre desencapado, três vezes ao redor de um parafuso de aço inoxidável (1 mm de diâmetro, comprimento de 2 mm). Aplicar o fluxo adequado para soldar o aço e soldar o fio de cobre a parte inferior da tampa da parafuso. Certifique-se de que o fundo metade da rosca permanece livre de solda de estanho.</li>
	<li>Use um multímetro padrão para verificar se há contato elétrico entre o fio e o parafuso.</li>
	<li>Desinfectar as canelas da sonda de silicone e os parafusos do chão por imersão em etanol a 70% (10 s).</li>
	<li>Prepare uma capa protetora para o implante de sonda cortando a cabeça de uma pipeta Pasteur de plástico ao meio.</li>
</ol>2. a implantação cirurgia
<ol><li>Esterilize instrumentos cirúrgicos (tesouras, pinças de ponta fina, grampos cirúrgicos) com um esterilizador de grânulo quente. Limpe todas as superfícies com etanol a 70%.</li>
	<li>Induzi a anestesia com isoflurano 3% de oxigénio fornecido em ~ 1 L/min.<ol>
<li>Para a manutenção, use 1-1,5% de isoflurano. Observe que a concentração de isoflurano necessária para obter tolerância cirúrgica pode variar de animal para animal.</li>
		<li>Tolerância cirúrgica estável é alcançada quando o animal não responder ao dedo do pé-beliscar. Monitorar a taxa de respiração do rato e ajustar a concentração de isoflurano, se necessário.</li>
		<li>Aplica a pomada para os olhos do animal para evitar que sequem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte o mouse em uma armação estereotáxica introduzindo suavemente barras de orelha no canal auditivo. Uma vez que a cabeça do rato é estabilizada por barras de orelha, coloque um pedaço de boca sobre o focinho para entrega contínua de isoflurano. Posicione o mouse na toalha ou almofada sobre uma almofada de aquecimento e injetar buprenorfina por via subcutânea (0,05 - 0,1 mg/kg de peso corporal) para assegurar analgesia pós-operatória.</li>
	<li>Raspar a cabeça com uma máquina de barbear padrão e desinfectar a pele com álcool 70%. Utilizando tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão na pele ao longo da linha média do crânio e abrir a pele usando grampos cirúrgicos.</li>
	<li>Alinhe a cabeça do animal com o auxílio de uma ferramenta de alinhamento estereotáxica para nível bregma e o lambda. Deve haver menos de 50 µm de deslocamento de altura entre o bregma e o lambda. Além disso, o nível a cabeça ao longo do eixo mediolateral medindo a profundidade do bregma no crânio de superfície no definido distâncias esquerdas e direita (por exemplo, 1 mm esquerda e direita do bregma). Se necessário, ajuste a inclinação da cabeça.</li>
	<li>Limpe a cabeça com 3% de peróxido de hidrogênio e seque com toalhitas de algodão estéril.</li>
	<li>Determine a localização da craniotomia em relação ao bregma usando um apropriado atlas estereotáxica12.</li>
	<li>Usando uma cabeça de broca de 0,9 mm, dois furos parafuso no osso sobre o cerebelo para colocar parafusos de chão e referência. Além disso, 1-3 furos para parafusos de ancoragem são desejáveis para estabilizar o implante. A localização dos parafusos de ancoragem dependerá da localização da craniotomia. Para implantação em hipocampo, coloque os parafusos de ancoragem sobre contralateral parietal e ipsilateral córtex frontal. Insira os parafusos no osso usando uma chave de fenda apropriada. Tome cuidado para não penetrar no cérebro.</li>
	<li>Execute a craniotomia diluindo lentamente o crânio com a broca em uma área retangular do lado de implantação. Frequentemente, umedeça o osso com tampão fosfato esterilizado (PB). O restante diluído crânio pode ser suavemente furou e removido com o auxílio de uma fina agulha de injeção (27G) e um par de pinças.</li>
	<li>Cuidadosamente, perfuram a dura-máter com uma fina agulha de injeção (27G). Formar um pequeno gancho, dobrando a ponta da agulha com um par de pinças e puxe a dura-máter para remoção. Aplica PB para impedir a secagem da superfície do cérebro.</li>
	<li>Montar a ferramenta de inserção de eletrodos em um titular estereotáxica, zero a sonda ao bregma e passar a sonda para as coordenadas estereotáxicos a craniotomia. Lentamente penetra a superfície do cérebro. Certifique-se de que não dobrar os eixos de sonda. Evite a implantação através de vasos sanguíneos.</li>
	<li>Abaixe lentamente a sonda até ~ 200 µm acima a profundidade desejada. Cobrir a craniotomia e shanks da sonda com vaselina esterilizada silicone para proteção. Aplique o cimento dental para fixar a base da sonda para o parafuso de ancoragem no crânio.</li>
	<li>Mesmo após a aplicação de cimento, mova lentamente a sonda até à profundidade de alvo. Avançando o último ~ 200 µm após aplicação do cimento reduz o movimento lateral da sonda e garante danos mínima dos tecidos na área alvo. Observe que o tempo de cura do cimento usado pode afetar esta etapa do protocolo. Com cimento de cura rapidamente, pular essa etapa e implante diretamente a sonda até à profundidade de alvo para evitar danos à sonda de silicone.</li>
	<li>Após o cimento tem curado, solte a sonda da ferramenta de inserção de derreter a cera com um cauterizador.</li>
	<li>Solte a placa de ligação do dispositivo de inserção e posicioná-lo em um local adequado no crânio usando uma pinça crocodilo associada a alça de inserção. No caso de implantação de sonda no hipocampo, coloque a placa de ligação no osso parietal contralateral. Fixe a placa de ligação no crânio usando cimento dental.</li>
	<li>Solde os fios terra e referência da placa de ligação para os fios ligados aos dois parafusos sobre o cerebelo.</li>
	<li>Guarnição da tampa protetora para a altura correta e coloque-o sobre a sonda de silicone. Fixe a capa para o conector placa e crânio usando cimento dental, evitando a pele ao redor do crânio exposta. Sutura da pele ao redor do local de implantação geralmente não é necessário.</li>
</ol>3. a recuperação após a cirurgia
<ol><li>Aplica tratamento analgésico apropriado pelo menos 2 dias (por exemplo, injecções subcutâneas de buprenorfina cada 6 h durante o dia e na água potável a noite combinada com carprofeno (4-5 mg/kg de peso corporal) por via subcutânea cada 24 h). Single-habitação é recomendado para evitar danos ao implante.</li>
	<li>Permitir que pelo menos uma semana para recuperação. Consulte as orientações locais de bem-estar animal.</li>
</ol>4. aquisição de dados
<ol><li>LFPs registros de ratos usando um sistema de aquisição de dados apropriado conectado através de um comutador movimentando-se livremente. Para adquirir LFPs, use uma frequência de amostragem de 1-5 kHz. Taxas de amostragem mais altas (20 a 30 kHz) são necessárias se unitárias descargas devem ser registados junto com a LFP.</li>
	<li>Armazenar arquivos de gravação crua dos canais individuais para análise off-line.</li>
</ol>5. histologia
<ol><li>Após a conclusão da gravação, profundamente anestesia o animal (por exemplo, 2g/kg corpo peso uretano injetado intraperitonealmente). Confirme o estado anestésico por falta de resposta aos pés de beliscar.</li>
	<li>Perfundir o rato transcardially com gelada fosfato salino (~ 1 min) seguido por paraformaldeído 4% (~ 10 min), usando padrão intracardíaca perfusão métodos13. Antes da perfusão, eletrolítico maciços dos sites gravação pode por executada (por exemplo, através da aplicação de 10-20 V de tensão constante para até 1 s). Alternativamente, corantes fluorescentes aplicados para as pontas da haste antes de implantação pode ser usada para controlar a identificação. Testar os diversos métodos para a identificação de posições de eletrodo para obter óptimos resultados com diferentes tipos de sondas de silicone é recomendado.</li>
	<li>Seções do cérebro (~ 100 µm) de corte e mancha as fatias com 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 µ g/mL) seguido por três etapas de lavagem em PB (cada 10 min à temperatura ambiente).</li>
	<li>Colocar as seções em um microscópio, aplicar uma gota de meio de incorporação e cobrir a seção com uma lamela. Deixe a incorporação média secar durante a noite em temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando um microscópio confocal de varredura a laser ou um epifluorescência, identifica a localização dos sítios a gravação.</li>
	<li>Para tentar a recuperação da sonda para ainda mais o uso do silicone, segure a sonda com uma pinça de crocodilo e lançar a sonda do scull pela fusão cuidadosamente o cimento dental com um ferro de solda (400 ° C). Tome cuidado para não tocar as canelas de sonda durante este procedimento.</li>
	<li>Lavar a sonda em água destilada (~ 80 ° C, 15min), seguida por solução enzimática (1% Tergazyme em água destilada, 30 min à temperatura ambiente) e outra lavagem em água destilada (15 min). Note que a taxa de sucesso de recuperação de sonda é baixa.</li>
</ol>6. CSD análise
<ol><li>Usando um ambiente de análise apropriado (por exemplo, Python), converte dados de LFP de uma haste individual a CSD por aproximação a segunda derivada espacial ao longo da haste como <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57714/57714eq1.jpg"> onde LFPn, t é o sinal LFP em nth eléctrodo no tempo t e Δz é do afastamento entre eletrodos inter. Note que devido as operações de n+ 1 e n-1, o CSD dos eléctrodos de primeira e últimos da haste não pode ser estimado, que tem que ser levado em consideração durante a colocação da sonda. Implemente a fórmula de aproximação usando um pequeno segmento de código que calcula o sinal CSD para cada eletrodo durante a iteração ao longo do tempo (ver arquivo de código suplementar).</li>
	<li>Use o sinal CSD obtido para uma análise mais adicional (por exemplo, estudando bandas de frequências específicas das oscilações do cérebro através da aplicação de filtros passa-faixa).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buzs&#225;ki, G., Draguhn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+oscillations+in+cortical+networks.">Neuronal oscillations in cortical networks.</a> Science. 304 (5679), 1926-1929 (2004).</li><li>Keefe, J., Recce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm.">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).</li><li>Benchenane, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+theta+oscillations+and+reorganization+of+spike+timing+in+the+hippocampal-prefrontal+network+upon+learning.">Coherent theta oscillations and reorganization of spike timing in the hippocampal-prefrontal network upon learning.</a> Neuron. 66 (6), 921-936 (2010).</li><li>Jadhav, S. P., Kemere, C., German, P. W., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Awake+hippocampal+sharp-wave+ripples+support+spatial+memory.">Awake hippocampal sharp-wave ripples support spatial memory.</a> Science. 336 (6087), 1454-1458 (2012).</li><li>Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+execution+of+working+memory+linked+to+synchronized+high-frequency+gamma+oscillations.">Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations.</a> Cell. 157 (4), 845-857 (2014).</li><li>Karalis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Hz+oscillations+synchronize+prefrontal-amygdala+circuits+during+fear+behavior.">4-Hz oscillations synchronize prefrontal-amygdala circuits during fear behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (4), 605-612 (2016).</li><li>Khodagholy, D., Gelinas, J. N., Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-enhanced+coupling+between+ripple+oscillations+in+association+cortices+and+hippocampus.">Learning-enhanced coupling between ripple oscillations in association cortices and hippocampus.</a> Science. 358 (6361), 369-372 (2017).</li><li>Buzs&#225;ki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG,+ECoG,+LFP+and+spikes.">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li><li>Mitzdorf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+source-density+method+and+application+in+cat+cerebral+cortex:+investigation+of+evoked+potentials+and+EEG+phenomena.">Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena.</a> Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).</li><li>Laszt&#243;czi, B., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+GABAergic+control+of+distinct+gamma+oscillations+in+the+CA1+hippocampus.">Layer-specific GABAergic control of distinct gamma oscillations in the CA1 hippocampus.</a> Neuron. 81 (5), 1126-1139 (2014).</li><li>Str&#252;ber, M., Sauer, J. -. F., Jonas, P., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distance-dependent+inhibition+facilitates+focality+of+gamma+oscillations+in+the+dentate+gyrus.">Distance-dependent inhibition facilitates focality of gamma oscillations in the dentate gyrus.</a> Nature Communications. 8 (1), 758 (2017).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kajikawa, Y., Schroeder, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+local+is+the+local+field+potential?.">How local is the local field potential?.</a> Neuron. 72 (5), 847-858 (2011).</li><li>Berens, P., Keliris, G. A., Ecker, A. S., Logothetis, N. K., Tolias, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+selectivity+of+the+gamma-band+of+the+local+field+potential+in+primate+primary+visual+cortex.">Feature selectivity of the gamma-band of the local field potential in primate primary visual cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 2 (2), 199-207 (2008).</li><li>Last&#243;czi, B., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gamma+oscillations+in+the+distal+dendritic+field+of+the+dentate+gyrus+and+the+CA1+area+of+mouse+hippocampus.">Distinct gamma oscillations in the distal dendritic field of the dentate gyrus and the CA1 area of mouse hippocampus.</a> Brain Structure and Function. 222 (7), 3355-3365 (2017).</li><li>Nguyen Chi, V., M&#252;ller, C., Wolfenstetter, T., Yanovsky, Y., Draguhn, A., Tort, A. B. L., Branka&#269;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+respiration-driven+rhythm+distinct+from+theta+oscillations+in+awake+mice.">Hippocampal respiration-driven rhythm distinct from theta oscillations in awake mice.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 162-177 (2016).</li><li>Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-drive+and+headgear+for+chronic+implant+and+recovery+of+optoelectronic+probes.">Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2773 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Evidências crescentes indicam que oscilações de cérebro em circuitos neuronais hippocampal ocorrem em domínios espaciais discretas10,11,16. Análise CSD reduz drasticamente a influência da condução de volume, um pré-requisito crucial para o estudo dos eventos de oscilação local. Com este vídeo, nós fornecemos um guia para implantar silicone sondas do hipocampo de rato para a análise de dados CSD. Mostramos exemplos representativos dos sinais CSD de onda afiada ondulações em CA1 e das oscilações gama localizada no giro denteado. No entanto, esse protocolo também pode ser usado para estudar outros padrões de atividade oscilatória hippocampal, como theta ou oscilações de rede relacionados com respiração17.
Sucesso da implantação depende crucialmente o alinhamento adequado da cabeça do animal na armação estereotáxica. Nós usamos uma agulha de injeção, fixada em um suporte estereotáxica para medir o desvio da cabeça nas direções anterioposterior e mediolateral. Nós sequencialmente mover a agulha para tocar o bregma e o lambda e compensar qualquer deslocamento entre as alturas dos dois pontos pela inclinação da armação estereotáxica. Da mesma forma, medir a altura de 1 mm à esquerda e à direita do bregma indicará qualquer deslocamento mediolateral, que pode ser ajustado pela inclinação do quadro esquerdo ou direito. Desloca < 50 µm são recomendados para obter melhores resultados de implantação.
Escolha do projeto sonda é outro aspecto crítico. Nossas simulações indicam que a capacidade de isolar os eventos locais declina com o aumento do afastamento entre eletrodos. Isolamos com êxito eventos de oscilação de gama localizadas usando sondas de silicone com 25 e 100 µm afastamento entre eletrodos e 250 e 400 µm haste espaçamento11. Essas métricas, assim, fornecem um bom ponto de partida para o projeto sonda.
Tendo em conta os elevados custos das sondas de silicone, reutilização das sondas gravação é atualmente um fator limitante. Os métodos descritos aqui permitam recuperação de sonda no principal. No entanto, apenas com êxito recuperamos a sonda após a gravação em uma instância, indicando que a taxa de sucesso deste procedimento é muito baixa. Futura melhoria do protocolo pode incluir o uso de microunidades destinadas a facilitar a recuperação de sonda18.

Oscilações na LFP criticamente estão envolvidas no processamento pelos circuitos neuronais de informações. Eles cobrem um amplo espectro de frequências, que variam de ondas lentas (~ 1 Hz) a ondulação rápido oscilações (~ 200 Hz)1. Bandas de frequências distintas estão associadas com funções cognitivas, incluindo memória, processamento emocional e navegação2,3,4,5,6,7. Fluxo de corrente através das membranas neuronais constitui a maior parte da LFP sinal8. Cações, entrando na célula (por exemplo, através da ativação de sinapses excitatório glutamatérgico) representam um coletor atual ativo (como carga deixa o meio extracelular). Em contraste, o fluxo líquido de carga positiva para o meio extracelular, por exemplo, a ativação de sinapses inibitórias gabaérgica, retrata uma fonte de corrente ativa naquele local. Em dipolos neuronais, atuais pias estão emparelhadas com fontes passivas e vice-versa devido a correntes de carga de membrana em locais distantes de compensação.
O campo elétrico produzido por processos neurais remotos também pode resultar em desvios de tensão considerável sobre um eletrodo de gravação e, portanto, pode ser falsamente considerado como um evento local. Esta condução volume constitui um sério desafio para a interpretação dos sinais da LFP. Análise CSD fornece informações sobre o locais atuais pias e fontes subjacentes LFP sinaliza e compreende, portanto, um meio para reduzir o impacto da condução de volume8. Em laminado estruturas como o hipocampo, sinais CSD unidimensionais podem ser obtidos pela segunda derivada espacial da LFP gravado da perpendicular equidistantes eletrodos dispostos ao laminar aviões9. O advento do silicone linear comercialmente disponíveis sondas permitiu aos pesquisadores utilizam o método de CDs para o estudo da atividade de oscilação local no hipocampo. Por exemplo, foi demonstrado que oscilações gama distintos emergem de forma camada específica no CA1 área10. Além disso, a análise CSD identificou pontos independentes da atividade de gama na camada de célula principal do giro denteado11. Importante, estas conclusões foram apenas aparentes no CSD local mas não em sinais LFP. Análise de CDs, portanto, fornece uma ferramenta poderosa para ganhar a introspecção em operações de microcircuito do hipocampo.
Neste protocolo, nós fornecemos um guia completo para obter sinais CSD unidimensionais com sondas de silicone. Estes métodos irão permitir que usuários investigar eventos oscilação localizadas no hipocampo de ratos de comportamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1106">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Crocodile clamp with stand</td>
			<td style="width:381px;">Reichelt Elektronik</td>
			<td style="width:151px;">HALTER ZD-10D</td>
			<td style="width:376px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Silicon probe</td>
			<td style="width:381px;">Cambridge Neurotech</td>
			<td style="width:151px;">P-series 32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:381px;">Olympus</td>
			<td style="width:151px;">SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Varnish-insulated copper wire</td>
			<td style="width:381px;">B&#252;rklin Elektronik</td>
			<td style="width:151px;">89 F 232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Ground screws</td>
			<td style="width:381px;">Screws &#38; More GmbH (screwsandmore.de)</td>
			<td style="width:151px;">DIN 84 A2 M1x2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Flux</td>
			<td style="width:381px;">Stannol</td>
			<td style="width:151px;">114018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Ceramic-tipped forceps</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">11210-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Paraffine Wax</td>
			<td style="width:381px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Cauterizer</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">18010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Soldering iron</td>
			<td style="width:381px;">Kurtz Ersa</td>
			<td style="width:151px;">OIC1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Multimeter</td>
			<td style="width:381px;">Uni-T</td>
			<td style="width:151px;">UT61C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Ethanol</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">EA65.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Heat sterilizer</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Stereotaxic frame</td>
			<td style="width:381px;">David Kopf</td>
			<td style="width:151px;">Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Stereotaxic electrode holder</td>
			<td style="width:381px;">David Kopf</td>
			<td style="width:151px;">Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:381px;">Abbvie</td>
			<td style="width:151px;">B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Oxygen concentrator</td>
			<td style="width:381px;">Respironix</td>
			<td style="width:151px;">1020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:381px;">Indivior UK Limited</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Electrical shaver</td>
			<td style="width:381px;">Tondeo</td>
			<td style="width:151px;">Eco-XS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Heating pad</td>
			<td style="width:381px;">Thermolux</td>
			<td style="width:151px;">463265/-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Surgical clamps</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:381px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Sterile cotton wipes</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">EH12.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Drill</td>
			<td style="width:381px;">Proxxon</td>
			<td style="width:151px;">Micromot 230/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">21G injection needle</td>
			<td style="width:381px;">B. Braun</td>
			<td style="width:151px;">4657527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Phosphate buffer/phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:381px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Stereotaxic atlas</td>
			<td style="width:381px;">Elsevier</td>
			<td style="width:151px;">9.78012E+12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">27G injection needles</td>
			<td style="width:381px;">B. Braun</td>
			<td style="width:151px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Vaseline</td>
			<td style="width:381px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Dental cement</td>
			<td style="width:381px;">Sun Medical</td>
			<td style="width:151px;">SuperBond T&#38;M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Carprofen</td>
			<td style="width:381px;">Zoetis</td>
			<td style="width:151px;">Rimadyl 50mg/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Recording amplifier</td>
			<td style="width:381px;">Intan Technologies</td>
			<td style="width:151px;">C3323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">USB acquisition board</td>
			<td style="width:381px;">Intan Technologies</td>
			<td style="width:151px;">C3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Recording cables</td>
			<td style="width:381px;">Intan Technologies</td>
			<td style="width:151px;">C3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Electrical commutator</td>
			<td style="width:381px;">Doric lenses</td>
			<td style="width:151px;">HRJ-OE_FC_12_HARW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Acquisition software</td>
			<td>OpenEphys (www.open-ephys.org)</td>
			<td style="width:151px;">GUI</td>
			<td>allows platform-independent data acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Computer for data acquisition</td>
			<td style="width:381px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Analysis environment</td>
			<td>Python (www.python.org)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>allows platform-independent data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Urethane</td>
			<td style="width:381px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Vibratome</td>
			<td style="width:381px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">VT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">H868.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Cover slips</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">H878.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Embedding medium</td>
			<td style="width:381px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">81381-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Distilled water</td>
			<td style="width:381px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">Milli Q</td>
			<td>Table-top machine for the production of distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Tergazyme</td>
			<td style="width:381px;">Alconox</td>
			<td style="width:151px;">Tergazyme</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recording spatially restricted oscillations in the hippocampus of behaving mice

O potencial do campo local (LFP) emerge de movimentos de íons através das membranas neurais. Desde que a tensão gravada por eletrodos LFP reflete o campo elétrico somado de um grande volume de tecido cerebral, extrair informações sobre a atividade local é um desafio. Estudando microcircuitos neuronais, no entanto, exige uma confiança distinção entre eventos verdadeiramente locais e volume-conduzido sinais originários de regiões distantes do cérebro. Análise de densidade (CSD) fonte atual oferece uma solução para este problema, fornecendo informação sobre dissipadores atuais e fontes na proximidade dos eléctrodos. Em áreas do cérebro com cytoarchitecture laminar, tais como o hipocampo, CSD unidimensional pode ser obtido, estimando-se a segunda derivada espacial da LFP. Aqui, descrevemos um método de registro multilaminar LFPs usando sondas de silicone linear implantadas no hipocampo dorsal. Vestígios CSD são calculados ao longo de hastes individuais da sonda. Assim, este protocolo descreve um procedimento para resolver espacialmente restrita rede neuronal oscilações no hipocampo de ratos movimentando-se livremente.

A Figura 1 ilustra a ferramenta de inserção utilizada para a implantação de sondas de silicone. Gravações de silício implantado cronicamente sondas segmentação da área CA1 e a camada de células grânulo de giro do pectínea são mostrados na Figura 2. Nós gravamos LFPs de Souza a sonda durante a livre circulação no homecage. Para minimizar o efeito de condução de volume, os sinais obtidos foram convertidos para CDs ao longo de cada haste da sonda (Figura 2BD). No primeiro exemplo mostrado na Figura 2B, uma única afiado-onda onda evento leva a um coletor atual proeminente no estrato radiatum de CA1. No segundo exemplo apresentado na Figura 2-E, nós gravamos de dois locais distintos na camada de célula grânulo do giro do pectínea (distância lateral 400 µm). A banda de alta gama foi isolada através da aplicação de um filtro passa-banda de 60-80 Hz para o sinal CSD, revelando rajadas de gama local em um dos dois sites de gravação localizados na camada de célula grânulo (Figura 2D; vermelho gravação local). Note-se que a atividade de oscilação local gama só pode ser detectada após a conversão dos sinais gravados para CSD (Figura 2D, direita). Figura 2E mostra períodos separados da mesma gravação, durante o qual as oscilações gama em ambos os sites de gravação diferem em sua fase (Figura 2E, à esquerda) ou amplitude (Figura 2E, médio). O exemplo mais à direita exibe uma época de actividade gama sincronizado em ambos os sites da gravação. Estes exemplos ilustram que a análise CSD é capaz de isolar a atividade local não só na dimensão de análise, mas também em direções perpendiculares. Para ilustrar ainda mais este conceito central, nós modelado um experimento com uma sonda de silicone, consistindo de duas hastes (I e II), com cinco locais de gravação, cada um em analogia com os resultados mostrados na Figura 2. Em nosso modelo, a sonda é implantada no giro denteado com uma oscilação de gama locais emergentes na camada de célula grânulo ao lado do local de gravação 4 da haste (Figura 3). Supondo que a condução de volume homogêneo em todo o tecido, a oscilação local será gravada na LFP em todos os outros locais de gravação em uma versão filtrada amplitude (Figura 3). No entanto, realizar análise de CDs ao longo de ambas as hastes claramente isola o locus da geração gama (Figura 3D). Além disso, o menor a distância entre os locais de gravação na mesma haste, quanto menor a interferência entre CSD sinaliza na vizinha shanks (Figura 3EF).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57714/57714fig1.jpg"> Figura 1: imagem da ferramenta inserção. A sonda de silício está ligada a um pino de inseto colado à base de uma pinça de crocodilo. O eixo do titular pode ser inserido em um manipulador de micro estereotáxica para implantação. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57714/57714fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57714/57714fig2.jpg"> Figura 2: resultados representativos das análises CSD no hipocampo. A: uma matriz de eletrodo consiste de uma sonda de silicone 4-haste (haste espaçamento 400 µm, eletrodo espaçamento 100 µm, 8 eletrodos/haste) foi implantada na área cornu ammonis 1 (CA1). A Shanks C atravessar o estrato oriens (o), estrato pyramidale (p) e estrato radiatum (r). HF: fissura hippocampal. DG: giro denteado. B: LFP (traços pretos) e CSD (Color-coded) de três desvios em CA1 durante uma época de 200 ms contendo uma espontânea afiado-onda ondulação evento. Observe o coletor atual proeminente no estrato radiatum. Barra de escala LFP: 2 mV. C: exemplo de uma sonda de silicone gravação da DG. Souza, A e B penetra o DG. CA3: área de ammonis cornu 3. Eletrolíticos lesões foram realizadas após a gravação para rotular faixas de eletrodo. D: desenho das patas do eletrodo em relação a anatomia hippocampal. LFP espacialmente de gravação de dois sites separados na camada de célula grânulo (vermelha e azul de gravação local) sugere que oscilações gama (60-80 Hz) são sincronizadas entre os dois locais (à esquerda). No entanto, sinais CSD do mesmo intervalo de tempo revelam uma gama focal 'hot spot' restringida para o local de gravação vermelho (à direita). CSD sinais de ambos os locais de gravação são desenhados na mesma escala. E: CSD mas não LFP sinais identificam períodos de fase (à esquerda) e assincronismo de amplitude (meio) entre os dois locais de gravação. A época da direita mostra uma breve época de actividade gama sincronizado. Traços no fundo ilustram a diferença de fase (Δ-fase em radianos) e o índice de diferença de amplitude (Ampl. índice, definido como a diferença de amplitude entre os dois locais de gravação, dividido pela soma das amplitudes em cada ponto de tempo, com um intervalo de -1 a 1) para LFP (cinza) e CSD (preto) vestígios. Todos os três exemplos são 30 ms longas e ocorreu dentro de 400 MS. os painéis C e D são adaptados de Strüber et al . 201711 sob Creative Commons (https://creativecommons.org/Licenses/by/4.0/). CSD sinais de ambos os locais de gravação são desenhados na mesma escala em cada painel individual. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57714/57714fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57714/57714fig3.jpg"> Figura 3: experimento de modelo com simulado focal 40 Hz oscilação na camada de célula grânulo de giro denteado. A: uma sonda de silicone modelo com duas hastes a uma distância de Dhaste = 400 µm e cinco locais de gravação localizado a uma distância Deletrodo = 100 µm é colocado no giro denteado. B: ao lado do local de gravação 4 da haste, uma oscilação de 40 Hz a focal é simulado como uma forma de onda senoidal mais Gaussian white noise. Em todos os outros sites, apenas ruído é induzido. Parâmetros: amplitude de gama: 1 mV; desvio-padrão de ruído: 0,05 mV; resolução temporal: 10 kHz. C: nós modelado o efeito de filtragem de amplitude da condução de volume através do espaço extracelular em uma maneira simplificada como um decaimento exponencial negativo de amplitudes de gama com uma constante de espaço de tecido de 500 µm. Os parâmetros exatos descrevendo corretamente a propagação lateral da LFP sinais são altamente controverso14. No entanto, nossa estimativa se ajusta bem aos dados de uma gama neocortical oscilação coerência estudo15. Na LFP resultante, a oscilação originalmente focal engloba vários sites de gravação. D: depois de executar a análise CSD dos poços individuais utilizando a equação de CSD determinada, a oscilação só é visível no local original. E: Análise de densidade espectral de potência da LFP (à esquerda, vermelho) e traços CSD (direita, azul) de sites 4 na haste de gravação I (linha pontilhada) e II (linha contínua). Observe que a análise CSD isola corretamente a oscilação de 40 Hz local na haste que enquanto a LFP der sinal contém atividade substancial volume-conduzido oscilação na haste II. Análise do PSD foi realizada usando a função de pwelch do MATLAB. F: Aumentando a distância entre os locais de gravações em hastes individuais a 400 µm resultados em uma redução da capacidade de análise CSD para isolar a atividade focal. Simulação e análise foi realizada usando MATLAB 7.10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57714/57714fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Este protocolo descreve a gravação dos potenciais de campo local com haste multi sondas de silicone linear. Conversão de sinais usando análise de densidade atual fonte permite a reconstrução do local atividade elétrica no hipocampo do mouse. Com esta técnica, oscilações espacialmente restrita do cérebro podem ser estudadas em ratos movimentando-se livremente.

Gravação espacialmente restrita oscilações no hipocampo de ratos de comportar-se

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

recording-spatially-restricted-oscillations-hippocampus-behaving

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K visualizações.  University of Freiburg. Este protocolo descreve a gravação dos potenciais de campo local com haste multi sondas de silicone linear. Conversão de sinais usando análise de densidade atual fonte permite a reconstrução do local atividade elétrica no hipocampo do mouse. Com esta técnica, oscilações espacialmente restrita do cérebro podem ser estudadas em ratos movimentando-se livremente.

Vídeo: Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

Derivação da glia Precursores restritos de camundongos E13

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Neurociência

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

Gravação Gama Oscilações banda em pedunculopontino Núcleo Neurônios

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Construção de um Hyperdrive melhorado de multi Tetrode para gravação Neural em grande escala em comportar-se ratos

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

A longo prazo conflito sensorial em livremente, comportando-se ratos

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording

The study of synaptic plasticity in the hippocampus has focused on the use of the CA3-CA1 lamellar network. Less attention has been given to the longitudinal interlamellar CA1-CA1 network. Recently however, an associational connection between CA1-CA1 pyramidal neurons has been shown. Therefore, there is the need to investigate whether the longitudinal interlamellar CA1-CA1 network of the hippocampus supports synaptic plasticity.
We designed a protocol to investigate the presence or absence of long-term synaptic plasticity in the interlamellar hippocampal CA1 network using electrophysiological field recordings both in vivo and in vitro. For in vivo extracellular field recordings, the recording and stimulation electrodes were placed in a septal-temporal axis of the dorsal hippocampus at a longitudinal angle, to evoke field excitatory postsynaptic potentials. For in vitro extracellular field recordings, hippocampal longitudinal slices were cut parallel to the septal-temporal plane. Recording and stimulation electrodes were placed in the stratum oriens (S.O) and the stratum radiatum (S.R) of the hippocampus along the longitudinal axis. This enabled us to investigate the directional and layer specificity of evoked excitatory postsynaptic potentials. Already established protocols were used to induce long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) both in vivo and in vitro. Our results demonstrated that the longitudinal interlamellar CA1 network supports N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor-dependent long-term potentiation (LTP) with no directional or layer specificity. The interlamellar network, however, in contrast to the transverse lamellar network, did not present with any significant long-term depression (LTD).

We used recording and stimulation electrodes in longitudinal hippocampal brain slices and longitudinally positioned recording and stimulation electrodes in the dorsal hippocampus in vivo to evoke extracellular postsynaptic potentials and demonstrate long-term synaptic plasticity along the longitudinal interlamellar CA1.

Investigando a plasticidade sináptica de longo prazo no hipocampo interlamelar CA1 por gravação de campo eletrofisiológico

The study of synaptic plasticity in the hippocampus has focused on the use of the CA3-CA1 lamellar network. Less attention has been given to the ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. Adeno-associated viruses (AAVs) are increasingly used to improve understanding of brain circuits and their functions. The AAV-mediated manipulation of specific cell populations and/or of precise molecular components has been tremendously useful to identify new sleep regulatory circuits/molecules and key proteins contributing to the adverse effects of sleep loss. For instance, inhibiting activity of the filamentous actin-severing protein&#160;cofilin&#160;using AAV prevents sleep deprivation-induced memory impairment. Here, a protocol is&#160;described that combines the manipulation of cofilin function in a cerebral cortex area with the recording of ECoG activity to examine whether cortical cofilin modulates the wakefulness and sleep ECoG signals. AAV injection is performed during the same surgical procedure as the implantation of ECoG and electromyographic (EMG) electrodes in adult male and female mice. Mice are anesthetized, and their heads are shaved. After skin cleaning and incision, stereotaxic coordinates of the motor cortex are determined, and the skull is pierced at this location. A cannula prefilled with an AAV expressing cofilinS3D, an inactive form of cofilin, is slowly positioned in the cortical tissue. After AAV infusion, gold-covered screws (ECoG electrodes) are screwed through the skull and cemented to the skull with gold wires inserted in the neck muscles (EMG electrodes). The animals are allowed three weeks to recover and to ensure sufficient expression of cofilinS3D. The infected area and cell type are verified using immunohistochemistry, and the ECoG is analyzed using visual identification of vigilance states and spectral analysis. In summary, this combined methodological approach allows the investigation of the precise contribution of molecular components regulating neuronal morphology and connectivity to the regulation of synchronized cerebral cortex activity during wakefulness and sleep.

This article describes a protocol for the manipulation of molecular targets in the cerebral cortex using adeno-associated viruses and for monitoring the effects of this manipulation during wakefulness and sleep using electrocorticographic recordings.

Registro eletrocorticográfico de áreas do córtex cerebral manipulado usando um vírus associado ao Adeno visando cofilina em camundongos

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.