Siamo grati a Karin Winterhalter e Kerstin Semmler per assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal cluster di eccellenza BrainLinks - BrainTools (EXC 1086) della Fondazione di ricerca tedesca.

Tutti i metodi che coinvolgono animali viventi sono stati approvati dal Friburgo Regierungspräsidium secondo il tedesco Animal Welfare Act.
1. preparati
<ol><li>Progettare e costruire lo strumento di inserimento appropriato transitoriamente portando la sonda di silicio e il connettore elettrodo durante il processo dell'impianto. Vedere la Figura 1 per un utensile costruito di esempio personalizzato.</li>
	<li>Rilasciare con attenzione il connettore sonda e l'elettrodo di silicio dalla confezione usando il forcipe con punta in ceramica.</li>
	<li>Sollevare la scheda connettore e fissare saldamente con una pinza coccodrillo collegata a uno stand.</li>
	<li>Utilizzando uno stereoscopio, allineare la sonda con lo strumento di inserimento con una pinza con punta in ceramica. Applicare uno strato di cera di paraffina fusa con un cauterizzatore per incollare la sonda per l'utensile di inserimento ~ 2 mm. Fare attenzione a non per toccare gli stinchi sonda durante questa procedura.</li>
	<li>Fissare il connettore elettrodo all'albero dello strumento di inserimento utilizzando nastro adesivo standard. Si noti che a seconda del produttore, fili di terra debba essere saldati sulla scheda connettore elettrodo prima dell'impianto. Rimuovere l'isolamento da due brevi pezzi di filo di rame isolato di vernice utilizzando saldare a stagno applicato con un saldatore (400 ° C). Saldare i fili di terra agli slot appropriato nel Consiglio del connettore di elettrodo.</li>
	<li>Rimuovere l'isolamento di due ulteriori pezzi di filo di rame. Avvolgere ogni filo di rame nudo tre volte intorno una vite in acciaio inox (diametro di 1 mm, 2 mm di lunghezza). Applicare flusso adatto a saldatura acciaio e saldare il filo di rame a fondo il tappo a vite. Assicurarsi che il fondo metà del filetto di vite rimane libero di saldare a stagno.</li>
	<li>Utilizzare un multimetro standard per controllare un contatto elettrico tra filo e vite.</li>
	<li>Disinfettare gli stinchi della sonda silicio e le viti di terra mediante immersione in etanolo al 70% (10 s).</li>
	<li>Preparare un coperchio di protezione per l'impianto di sonda tagliando la testa di una pipetta Pasteur di plastica a metà.</li>
</ol>2. l'impianto chirurgia
<ol><li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici (forbici, pinze a punta fine, clamp chirurgiche) con uno sterilizzatore caldo perlina. Pulire tutte le superfici con etanolo al 70%.</li>
	<li>Indurre l'anestesia con isoflurano 3% in ossigeno erogato a ~ 1 L/min.<ol>
<li>Per la manutenzione, utilizzare 1-1.5% isoflurane. Si noti che la concentrazione di isoflurane per ottenere tolleranza chirurgica necessaria può variare da animale ad animale.</li>
		<li>Tolleranza di chirurgica stabile si ottiene quando l'animale non risponde a punta-pizzicamento. Monitorare il tasso di respirazione del mouse e se necessario, regolare la concentrazione di isoflurane.</li>
		<li>Applicare unguento per gli occhi dell'animale per evitare l'essiccazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montare il mouse in una cornice stereotassica inserendo delicatamente bar orecchio nel condotto uditivo. Una volta che la testa del mouse è stabilizzata tramite le barre di orecchio, è possibile posizionare un pezzo di bocca sopra il muso per il recapito continuo isoflurano. Posizionare il mouse sul tovagliolo o pad sopra un rilievo del heating e iniettare per via sottocutanea buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg di peso corporeo) per garantire l'analgesia postoperatoria.</li>
	<li>Radersi la testa con un rasoio standard e disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Utilizzando le forbici chirurgiche, fare un'incisione nella pelle lungo la linea mediana del cranio e aprire la pelle utilizzando pinze chirurgiche.</li>
	<li>Allineare la testa dell'animale con l'ausilio di uno strumento di allineamento stereotassica a livello bregma e lambda. Ci dovrebbe essere meno di 50 µm di offset di altezza tra bregma e lambda. Inoltre, la testa lungo l'asse mediolateral misurando la profondità dal bregma al cranio in superficie al livello definito Distanze destra e sinistra (ad es., 1 mm a sinistra e destra di bregma). Se necessario, regolare l'inclinazione della testa.</li>
	<li>Pulire la testina con 3% di perossido di idrogeno e asciugare con salviette di cotone sterile.</li>
	<li>Determinare la posizione del craniotomy rispetto al bregma utilizzando un appropriato Atlante stereotassiche12.</li>
	<li>Utilizzando una testa del trivello di 0.9 mm, praticare due fori per le viti nell'osso sopra il cervelletto per posizionare le viti di terra e di riferimento. Inoltre, 1-3 fori per viti di ancoraggio sono desiderabili per stabilizzare l'impianto. La posizione delle viti di ancoraggio dipenderà la posizione del craniotomy. Per l'impianto nell'ippocampo, posizionare le viti di ancoraggio sopra corteccia frontale omolaterale e parietale controlaterale. Inserire le viti nell'osso con un cacciavite adatto. Fare attenzione a non per penetrare nel cervello.</li>
	<li>Eseguire il craniotomy fluidificando lentamente il cranio con il trapano in un'area rettangolare intorno al lato dell'impianto. Inumidire frequentemente l'osso con tampone fosfato sterile (PB). Il cranio assottigliato rimanente possa essere delicatamente trafitto e rimosso con l'aiuto di un ago sottile di iniezione (27G) e un paio di pinzette.</li>
	<li>Perforare con attenzione il mater di dura con un sottile ago per iniezione (27G). Formare un piccolo gancio piegando la punta dell'ago con un paio di pinzette e tirare il dura per la rimozione. Applicare PB per evitare che la superficie del cervello dall'asciugarsi.</li>
	<li>Montare l'utensile di inserimento elettrodo su un supporto stereotassica, zero la sonda il bregma e muovere la sonda alle coordinate stereotassiche sopra il craniotomy. Lentamente penetrare la superficie del cervello. Assicurarsi di che non piegare gli alberi di sonda. Evitare l'impianto attraverso i vasi sanguigni.</li>
	<li>Abbassare lentamente la sonda fino a ~ 200 µm sopra la profondità desiderata. Coprire il craniotomy e tibia della sonda silicio con vaselina sterile per la protezione. Applicare il cemento dentale per fissare la base della sonda e la vite di ancoraggio nel cranio.</li>
	<li>Proprio dopo l'applicazione del cemento, muovere lentamente la sonda fino alla profondità di destinazione. Dopo l'applicazione del cemento riduce il movimento laterale della sonda e garantisce danno di tessuto minimo nella zona di destinazione, avanzando l'ultima ~ 200 µm. Si noti che il tempo di polimerizzazione del cemento utilizzato può influenzare questo passaggio del protocollo. Con rapido indurimento cemento, omettere questo passaggio e di impianto direttamente la sonda fino alla profondità di destinazione al fine di evitare danni alla sonda di silicio.</li>
	<li>Dopo che il cemento ha guarito, rilasciare la sonda dallo strumento di inserimento fondendo la cera con un cauterizzatore.</li>
	<li>Rilasciare il connettore piastra dal dispositivo di inserimento e posizionarlo in un punto adatto sul cranio utilizzando una pinza coccodrillo connesso all'handle di inserimento. In caso l'impianto sonda nell'ippocampo, posizionare la scheda di connettore sull'osso parietale controlaterale. Fissare il connettore a bordo al cranio mediante cemento dentale.</li>
	<li>Saldare i fili di terra e di riferimento della scheda connettore per i cavi fissati alle due viti sopra il cervelletto.</li>
	<li>Tagliare il coperchio di protezione all'altezza corretta e metterlo sopra la sonda di silicio. Fissare il coperchio del connettore piastra e cranio utilizzando cemento dentale, evitando la pelle intorno le esposte del cranio. Solitamente non è necessario suturare la pelle intorno al sito di impianto.</li>
</ol>3. il recupero dopo l'intervento chirurgico
<ol><li>Applicare il trattamento analgesico appropriato per almeno 2 giorni (ad es. le iniezioni sottocutanee di buprenorfina ogni 6 h durante il giorno e nell'acqua da bere durante la notte combinato con carprofen (4-5 mg/kg di peso corporeo) per via sottocutanea ogni 24 h). Singolo-alloggiamento è consigliato per evitare danni all'impianto.</li>
	<li>Consentire almeno una settimana per il recupero. Consultare le linee guida locali benessere degli animali.</li>
</ol>4. acquisizione dati
<ol><li>LFPs record da topi utilizzando un sistema di acquisizione dati adatto collegato tramite un commutatore di muoversi liberamente. Per acquisire LFPs, utilizzano una frequenza di campionamento di 1-5 kHz. Frequenze di campionamento più elevati (20-30 kHz) sono necessari se gli scarichi unitario devono essere registrati con la LFP.</li>
	<li>Memorizzare i file di registrazione raw dei singoli canali per l'analisi offline.</li>
</ol>5. istologia
<ol><li>Dopo il completamento della registrazione, profondamente anestetizzare l'animale (per esempio 2 g/kg corpo peso uretano iniettato intraperitonealmente). Confermare lo stato anestetico dalla mancanza di risposta a pizzicare le dita.</li>
	<li>Irrorare il mouse via con gelida tampone fosfato salino (~ 1 min) seguita da paraformaldeide al 4% (~ 10 min) utilizzando standard intracardiaca aspersione metodi13. Prima di aspersione, lesioning elettrolitico dei siti di registrazione potrebbe da eseguire (ad es. mediante l'applicazione di 10-20 V di tensione costante per fino a 1 s). In alternativa, tinture fluorescenti applicato alle punte gambo prima che l'impianto può essere utilizzato per tenere traccia di identificazione. Prova i vari metodi per l'identificazione delle posizioni di elettrodo per ottenere risultati ottimali con diversi tipi di sonde di silicio è raccomandato.</li>
	<li>Tagliare sezioni del cervello (~ 100 µm) e macchiare le fette con 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 µ g/mL) seguita da tre lavaggi in PB (ogni 10 min a temperatura ambiente).</li>
	<li>Posto le sezioni su un vetrino da microscopio, applicare una goccia di mezzo di inclusione e coprire la sezione con un vetrino coprioggetto. Lasciate che l'incasso media asciugare durante la notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzando un epifluorescenza o microscopio confocale a scansione laser, identificare la posizione dei siti di registrazione.</li>
	<li>Per tentare il recupero della sonda silicio per un ulteriore uso, tenere la sonda con un morsetto a coccodrillo e rilasciare la sonda dal cranio fondendo attentamente il cemento dentale con un saldatore (400 ° C). Fare attenzione a non per toccare gli stinchi sonda durante questa procedura!</li>
	<li>Lavare la sonda con acqua distillata (~ 80 ° C, 15 min) seguita da una soluzione enzimatica (1% Tergazyme in acqua distillata, 30 min a temperatura ambiente) e passo un altro lavaggio in acqua distillata (15 min). Nota che il tasso di successo di recupero sonda è basso.</li>
</ol>6. CSD analisi
<ol><li>Utilizzando un ambiente di analisi adeguati (ad es. Python), convertire dati LFP di un gambo di singolo per CSD approssimando la seconda derivata spaziale lungo la tibia come <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57714/57714eq1.jpg"> dove LFPn, t è il segnale LFP sull'elettrodo nth al tempo t e Δz è la spaziatura inter-elettrodo. Si noti che a causa della n-1 e n+ 1 operazioni, il CSD degli elettrodi primi e l'ultimi del gambo non può essere stimata, che deve essere preso in considerazione durante il posizionamento della sonda. Implementare la formula di approssimazione utilizzando un breve segmento di codice che calcola il segnale CSD per ciascun elettrodo durante lo scorrimento nel tempo (Vedi File di codice supplementare).</li>
	<li>Utilizzare il segnale CSD ottenuto per ulteriori analisi (ad esempio, studiando specifiche bande di frequenza delle oscillazioni del cervello applicando filtri passa-banda).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buzs&#225;ki, G., Draguhn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+oscillations+in+cortical+networks.">Neuronal oscillations in cortical networks.</a> Science. 304 (5679), 1926-1929 (2004).</li><li>Keefe, J., Recce, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+relationship+between+hippocampal+place+units+and+the+EEG+theta+rhythm.">Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm.</a> Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).</li><li>Benchenane, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+theta+oscillations+and+reorganization+of+spike+timing+in+the+hippocampal-prefrontal+network+upon+learning.">Coherent theta oscillations and reorganization of spike timing in the hippocampal-prefrontal network upon learning.</a> Neuron. 66 (6), 921-936 (2010).</li><li>Jadhav, S. P., Kemere, C., German, P. W., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Awake+hippocampal+sharp-wave+ripples+support+spatial+memory.">Awake hippocampal sharp-wave ripples support spatial memory.</a> Science. 336 (6087), 1454-1458 (2012).</li><li>Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+execution+of+working+memory+linked+to+synchronized+high-frequency+gamma+oscillations.">Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations.</a> Cell. 157 (4), 845-857 (2014).</li><li>Karalis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Hz+oscillations+synchronize+prefrontal-amygdala+circuits+during+fear+behavior.">4-Hz oscillations synchronize prefrontal-amygdala circuits during fear behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (4), 605-612 (2016).</li><li>Khodagholy, D., Gelinas, J. N., Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-enhanced+coupling+between+ripple+oscillations+in+association+cortices+and+hippocampus.">Learning-enhanced coupling between ripple oscillations in association cortices and hippocampus.</a> Science. 358 (6361), 369-372 (2017).</li><li>Buzs&#225;ki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+extracellular+fields+and+currents--EEG,+ECoG,+LFP+and+spikes.">The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).</li><li>Mitzdorf, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+source-density+method+and+application+in+cat+cerebral+cortex:+investigation+of+evoked+potentials+and+EEG+phenomena.">Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena.</a> Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).</li><li>Laszt&#243;czi, B., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+GABAergic+control+of+distinct+gamma+oscillations+in+the+CA1+hippocampus.">Layer-specific GABAergic control of distinct gamma oscillations in the CA1 hippocampus.</a> Neuron. 81 (5), 1126-1139 (2014).</li><li>Str&#252;ber, M., Sauer, J. -. F., Jonas, P., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distance-dependent+inhibition+facilitates+focality+of+gamma+oscillations+in+the+dentate+gyrus.">Distance-dependent inhibition facilitates focality of gamma oscillations in the dentate gyrus.</a> Nature Communications. 8 (1), 758 (2017).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kajikawa, Y., Schroeder, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+local+is+the+local+field+potential?.">How local is the local field potential?.</a> Neuron. 72 (5), 847-858 (2011).</li><li>Berens, P., Keliris, G. A., Ecker, A. S., Logothetis, N. K., Tolias, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+selectivity+of+the+gamma-band+of+the+local+field+potential+in+primate+primary+visual+cortex.">Feature selectivity of the gamma-band of the local field potential in primate primary visual cortex.</a> Frontiers in Neuroscience. 2 (2), 199-207 (2008).</li><li>Last&#243;czi, B., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gamma+oscillations+in+the+distal+dendritic+field+of+the+dentate+gyrus+and+the+CA1+area+of+mouse+hippocampus.">Distinct gamma oscillations in the distal dendritic field of the dentate gyrus and the CA1 area of mouse hippocampus.</a> Brain Structure and Function. 222 (7), 3355-3365 (2017).</li><li>Nguyen Chi, V., M&#252;ller, C., Wolfenstetter, T., Yanovsky, Y., Draguhn, A., Tort, A. B. L., Branka&#269;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+respiration-driven+rhythm+distinct+from+theta+oscillations+in+awake+mice.">Hippocampal respiration-driven rhythm distinct from theta oscillations in awake mice.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 162-177 (2016).</li><li>Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-drive+and+headgear+for+chronic+implant+and+recovery+of+optoelectronic+probes.">Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2773 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Crescenti evidenze indicano che le oscillazioni del cervello in circuiti neuronali ippocampali si presentano in domini spaziali discreti10,11,16. Analisi CSD riduce drasticamente l'influenza della conduzione di volume, un presupposto fondamentale per lo studio degli eventi di oscillazione locale. Con questo video, forniamo una guida per impiantare punte in silicio nell'ippocampo del mouse per l'analisi dei dati CSD. Vi mostriamo esempi rappresentativi dei segnali CSD di sharp-onda Increspature in CA1 e delle oscillazioni di gamma localizzata nella circonvoluzione dentata. Tuttavia, questo protocollo utilizzabile anche per studiare altri modelli hippocampal attività oscillatoria, come theta o rete di respirazione-relative oscillazioni17.
Successo dell'impianto dipende fondamentalmente il corretto allineamento della testa dell'animale nella cornice stereotassica. Utilizziamo un ago per iniezione vincolato in un titolare stereotassica per misurare la deviazione di testa in direzione anteroposteriore e mediolateral. Ci muoviamo in sequenza l'ago di toccare bregma e lambda e compensare eventuali scostamenti tra le altezze di entrambi i punti inclinando la cornice stereotassica. Allo stesso modo, misurare l'altezza a 1 mm sinistro e destro di bregma indicherà eventuali offset mediolaterale, che può essere regolata inclinando il telaio sinistro o destro. Offset < 50 µm sono consigliati per ottenere i migliori risultati l'impianto.
Scelta del design della sonda è un altro aspetto critico. Le nostre simulazioni indicano che la capacità di isolare gli eventi locali diminuisce con l'aumento della distanza tra elettrodo. Abbiamo isolato con successo eventi di oscillazione gamma localizzata utilizzando punte in silicio con 25 e 100 µm elettrodo spaziatura e 250 e 400 µm tibia spaziatura11. Queste metriche, quindi, fornire un buon punto di partenza per la progettazione di sonda.
Dato gli alti costi del silicio, riutilizzabilità delle sonde registrazione è attualmente un fattore limitante. I metodi descritti qui consentono in capitale per il recupero della sonda. Tuttavia, abbiamo solo recuperato con successo la sonda dopo la registrazione in un caso, che indica che il tasso di successo di tale procedura è molto basso. Miglioramenti futuri del protocollo possono includere l'uso di micro-drive progettato per facilitare la sonda recupero18.

Oscillazioni in LFP sono criticamente coinvolti nell'elaborazione di circuiti neuronali dell'informazione. Essi coprono un ampio spettro di frequenze, che vanno da onde lente (~ 1 Hz) a ripple veloce oscillazioni (~ 200 Hz)1. Bande di frequenza distinte sono associati con funzioni cognitive tra cui memoria, elaborazione emotiva e navigazione2,3,4,5,6,7. Flusso di corrente attraverso le membrane neuronali costituisce la più grande parte del segnale LFP8. Cationi di entrare nella cellula (per esempio attraverso l'attivazione di sinapsi eccitatorie glutammatergiche) rappresentano un dissipatore attivo corrente (come carica lascia medium extracellulare). Al contrario, flusso netto di carica positiva al medium extracellulare, ad esempio dall'attivazione delle sinapsi inibitorie di neuroni GABAergici, raffigura una fonte di corrente attiva in quella posizione. In un neurone dipoli, sink corrente sono accoppiati con fonti passive e viceversa a causa di correnti elettriche che interessano la membrana carica ai luoghi distanti di compensazione.
Il campo elettrico prodotto da remoti processi neurali può anche provocare deviazioni notevole tensione su un elettrodo di registrazione e così potrebbe essere erroneamente considerato come un evento locale. Questa conduzione di volume pone una seria sfida per l'interpretazione dei segnali LFP. CSD analisi fornisce informazioni locali corrente Lavelli e fonti sottostante LFP segnali e quindi costituito un mezzo per ridurre l'impatto del volume di conduzione8. In laminato strutture come l'ippocampo, unidimensionale CSD segnali possono essere ottenuti dalla seconda derivata spaziale di LFP registrata dalla perpendicolare equidistante elettrodi disposti ai piani laminare9. L'avvento di silicio lineare commercialmente disponibili sonde ha permesso ai ricercatori di utilizzare il metodo CSD per lo studio dell'attività di oscillazione locale nell'ippocampo. Ad esempio, è stato dimostrato che le oscillazioni gamma distinte emergono in maniera strato-specifica nella zona CA110. Inoltre, l'analisi CSD ha identificato indipendente hot spot di attività gamma nello strato delle cellule principali del giro dentato11. D'importanza, questi risultati erano solo apparenti in CSD locale ma non in segnali LFP. Analisi CSD fornisce così un potente strumento per guadagnare la comprensione nelle operazioni microcircuito dell'ippocampo.
In questo protocollo, forniamo una guida completa per ottenere segnali di CSD unidimensionali con punte in silicio. Questi metodi consentirà agli utenti di studiare gli eventi di oscillazione localizzato nell'ippocampo dei topi si comporta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1106">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Crocodile clamp with stand</td>
			<td style="width:381px;">Reichelt Elektronik</td>
			<td style="width:151px;">HALTER ZD-10D</td>
			<td style="width:376px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Silicon probe</td>
			<td style="width:381px;">Cambridge Neurotech</td>
			<td style="width:151px;">P-series 32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:381px;">Olympus</td>
			<td style="width:151px;">SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Varnish-insulated copper wire</td>
			<td style="width:381px;">B&#252;rklin Elektronik</td>
			<td style="width:151px;">89 F 232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:199px;">Ground screws</td>
			<td style="width:381px;">Screws &#38; More GmbH (screwsandmore.de)</td>
			<td style="width:151px;">DIN 84 A2 M1x2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Flux</td>
			<td style="width:381px;">Stannol</td>
			<td style="width:151px;">114018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Ceramic-tipped forceps</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">11210-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Paraffine Wax</td>
			<td style="width:381px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Cauterizer</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">18010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Soldering iron</td>
			<td style="width:381px;">Kurtz Ersa</td>
			<td style="width:151px;">OIC1300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Multimeter</td>
			<td style="width:381px;">Uni-T</td>
			<td style="width:151px;">UT61C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Ethanol</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">EA65.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Heat sterilizer</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Stereotaxic frame</td>
			<td style="width:381px;">David Kopf</td>
			<td style="width:151px;">Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Stereotaxic electrode holder</td>
			<td style="width:381px;">David Kopf</td>
			<td style="width:151px;">Model 1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:381px;">Abbvie</td>
			<td style="width:151px;">B506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Oxygen concentrator</td>
			<td style="width:381px;">Respironix</td>
			<td style="width:151px;">1020007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:381px;">Indivior UK Limited</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Electrical shaver</td>
			<td style="width:381px;">Tondeo</td>
			<td style="width:151px;">Eco-XS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Heating pad</td>
			<td style="width:381px;">Thermolux</td>
			<td style="width:151px;">463265/-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Surgical clamps</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">18050-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:381px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Sterile cotton wipes</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">EH12.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Drill</td>
			<td style="width:381px;">Proxxon</td>
			<td style="width:151px;">Micromot 230/E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">21G injection needle</td>
			<td style="width:381px;">B. Braun</td>
			<td style="width:151px;">4657527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Phosphate buffer/phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:381px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Stereotaxic atlas</td>
			<td style="width:381px;">Elsevier</td>
			<td style="width:151px;">9.78012E+12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Surgical forceps</td>
			<td style="width:381px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:151px;">11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">27G injection needles</td>
			<td style="width:381px;">B. Braun</td>
			<td style="width:151px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Vaseline</td>
			<td style="width:381px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Dental cement</td>
			<td style="width:381px;">Sun Medical</td>
			<td style="width:151px;">SuperBond T&#38;M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Carprofen</td>
			<td style="width:381px;">Zoetis</td>
			<td style="width:151px;">Rimadyl 50mg/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Recording amplifier</td>
			<td style="width:381px;">Intan Technologies</td>
			<td style="width:151px;">C3323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">USB acquisition board</td>
			<td style="width:381px;">Intan Technologies</td>
			<td style="width:151px;">C3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Recording cables</td>
			<td style="width:381px;">Intan Technologies</td>
			<td style="width:151px;">C3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Electrical commutator</td>
			<td style="width:381px;">Doric lenses</td>
			<td style="width:151px;">HRJ-OE_FC_12_HARW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Acquisition software</td>
			<td>OpenEphys (www.open-ephys.org)</td>
			<td style="width:151px;">GUI</td>
			<td>allows platform-independent data acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Computer for data acquisition</td>
			<td style="width:381px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Analysis environment</td>
			<td>Python (www.python.org)</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>allows platform-independent data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Urethane</td>
			<td style="width:381px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Vibratome</td>
			<td style="width:381px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">VT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">H868.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Cover slips</td>
			<td style="width:381px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:151px;">H878.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Embedding medium</td>
			<td style="width:381px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">81381-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Distilled water</td>
			<td style="width:381px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">Milli Q</td>
			<td>Table-top machine for the production of distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Tergazyme</td>
			<td style="width:381px;">Alconox</td>
			<td style="width:151px;">Tergazyme</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recording spatially restricted oscillations in the hippocampus of behaving mice

Il potenziale di campo locale (LFP) emerge dai movimenti di ioni attraverso le membrane neurali. Poiché la tensione registrata dagli elettrodi LFP riflette il campo elettrico sommato di un grande volume di tessuto cerebrale, l'estrazione di informazioni sulle attività locali è impegnativo. Studiare un neurone microcircuiti, tuttavia, richiede una distinzione certa tra eventi veramente locali e volume-condotto segnali provenienti da zone lontane del cervello. Analisi di densità (CSD) di origine corrente offre una soluzione per questo problema fornendo informazioni sulle origini in prossimità degli elettrodi e i sink corrente. Nelle aree del cervello con laminare cytoarchitecture quale l'ippocampo, CSD unidimensionale può essere ottenuto calcolando la derivata seconda spaziale della LFP. Qui, descriviamo un metodo per registrare multilaminare LFPs usando le sonde lineari silicio impiantati nell'ippocampo dorsale. CSD tracce vengono calcolate lungo singoli steli della sonda. Questo protocollo descrive così una procedura per risolvere oscillazioni spazialmente limitata rete neuronale nell'ippocampo dei topi liberi di muoversi.

La figura 1 illustra l'utensile utilizzato per l'impianto di silicio. Registrazioni dal silicio cronicamente impiantato sonde come target l'area CA1 e lo strato delle cellule del granello di circonvoluzione dentata sono mostrati nella Figura 2. Abbiamo registrato LFPs dalla tibia sonda durante la libera circolazione nella homecage. Per minimizzare l'effetto della conduzione di volume, i segnali ottenuti sono stati convertiti alla CSD lungo ogni gambo della sonda (Figura 2BD). Nel primo esempio mostrato nella Figura 2B, una singola tagliente-onda ondulazione evento conduce ad un dissipatore di corrente prominente in strato radiato di CA1. Nel secondo esempio visualizzato nella Figura 2-Eabbiamo registrato da due siti distinti nello strato delle cellule del granello di circonvoluzione dentata (distanza laterale 400 µm). La fascia di alta-gamma è stata isolata mediante l'applicazione di un filtro passa-banda di 60-80 Hz per il segnale CSD, rivelando lampi gamma locale su uno dei due siti di registrazione che si trova nello strato delle cellule del granello (Figura 2D; registrazione rosso sito). Si noti che l'attività di oscillazione locale gamma possono essere rilevati solo dopo la conversione di segnali registrati al CSD (Figura 2D, destra). Figura 2E Mostra periodi di tempo separati della stessa registrazione, durante il quale oscillazioni di gamma su entrambi i siti registrazione differiscono nella loro fase (Figura 2E, sinistra) o l'ampiezza (Figura 2E, medio). Nell'esempio a destra viene visualizzato un'epoca di attività gamma sincronizzata su entrambi i siti registrazione. Questi esempi illustrano che CSD analisi è in grado di isolare le attività locali non solo nella dimensione di analisi, ma anche in direzioni perpendicolari. Per illustrare ulteriormente questo concetto centrale, abbiamo modellato un esperimento con una sonda di silicio che consiste di due steli (I e II) con cinque siti di registrazione, ciascuna in analogia con i risultati mostrati nella Figura 2. Nel nostro modello, la sonda viene impiantata nella circonvoluzione dentata con un'oscillazione di gamma locali emergenti nello strato delle cellule del granello accanto al sito di registrazione 4 della tibia (Figura 3). Supponendo di conduzione volume omogeneo in tutto il tessuto, l'oscillazione locale sarà registrato nella LFP a tutti gli altri siti di registrazione in una versione filtrata in ampiezza (Figura 3). Tuttavia, l'analisi CSD lungo entrambi tibia isola chiaramente il locus della generazione di gamma (Figura 3D). Inoltre, la più piccola è la distanza tra siti di registrazione del gambo stesso, più piccolo il crosstalk tra CSD segnali vicini shanks (Figura 3EF).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57714/57714fig1.jpg"> Figura 1: immagine dello strumento inserimento. La sonda di silicio è collegata ad un pin insetto incollato alla base di un morsetto a coccodrillo. L'albero del titolare può essere inserito in un manipolatore micro stereotassica per l'impianto. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57714/57714fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57714/57714fig2.jpg"> Figura 2: risultati rappresentativi di analisi CSD nell'ippocampo. A: un array di elettrodi che consiste di una sonda di silicio quattro-tibia (tibia spaziatura 400 µm, elettrodo spaziatura 100 µm, 8 elettrodi/tibia) è stato impiantato nella zona cornu ammonis 1 (CA1). Shanks A-C traverse strato oriens (o), strato pyramidale (p) e strato radiato (r). HF: Scissura ippocampale. DG: giro dentato. B: LFP (tracce nere) e CSD (color-coded) delle tre steli in CA1 durante un'epoca di 200 ms contenente una spontanea sharp-onda ondulazione evento. Si noti il sink corrente prominente in strato radiato. Barra della scala LFP: 2 mV. C: esempio di una sonda di silicio registrazione della DG. Tibia A e B penetra il DG. CA3: area di ammonis cornu 3. Elettrolitiche lesioni sono state effettuate dopo la registrazione per etichettare le tracce dell'elettrodo. D: disegno degli stinchi di elettrodo in relazione all'anatomia hippocampal. LFP registrazione nello spazio da due siti separati nello strato delle cellule del granello (rosso e blu registrazione sito) suggerisce che le oscillazioni di gamma (60-80 Hz) vengono sincronizzate tra entrambi i siti (a sinistra). Tuttavia, i segnali CSD di stesso intervallo di tempo rivelano una gamma focale 'hot spot' limitata al sito di registrazione rosso (a destra). CSD segnali da entrambi i siti registrazione sono disegnati con la stessa scala. E: segnali CSD ma non LFP identificano periodi di fase (a sinistra) e asincronia di ampiezza (al centro) tra due siti di registrazione. L'epoca sulla destra mostra una breve epoca di attività gamma sincronizzato. Tracce sul fondo illustrano la differenza di fase (Δ-fase in radianti) e indice di differenza di ampiezza (Ampl. indice, definito come la differenza di ampiezza tra due siti di registrazione diviso per la somma delle ampiezze in ogni momento con un intervallo da -1 a 1) per LFP (grigio) e CSD (nero) tracce. Tutti i tre esempi sono 30 ms lunga e si è verificato all'interno di 400 ms. pannelli C e D sono adattati da Strüber et al 201711 sotto Creative Commons (https://creativecommons.org/Licenses/by/4.0/). CSD segnali da entrambi i siti registrazione sono disegnati con la stessa scala in ogni singolo pannello. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57714/57714fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57714/57714fig3.jpg"> Figura 3: modello sperimentale con simulato focale 40Hz oscillazione nello strato delle cellule del granello di circonvoluzione dentata. A: una sonda di silicio modello con due steli ad una distanza di Dgambo = 400 µm e cinque siti di registrazione situato ad una distanza Delettrodo = 100 µm è collocato nella circonvoluzione dentata. B: accanto al sito di registrazione 4 della tibia, un'oscillazione di 40 Hz focale è simulato come una forma d'onda sinusoidale plus gaussiana rumore bianco. A tutti gli altri siti, è indotta solo rumore. Parametri: ampiezza di gamma: 1 mV; deviazione standard del rumore: 0.05 mV; risoluzione temporale: 10 kHz. C: abbiamo modellato l'ampiezza-filtro effetto della conduzione di volume attraverso lo spazio extracellulare in modo semplificato come un decadimento esponenziale negativo delle ampiezze di gamma con una costante di spazio del tessuto di 500 µm. I parametri esatti correttamente che descrivono la diffusione laterale dei segnali LFP sono altamente controverso14. Tuttavia, la nostra stima si adatta bene ai dati da una gamma neocortical oscillazione coerenza Studio15. Nella LFP risultante, l'oscillazione originariamente focale comprende diversi siti di registrazione. D: dopo aver eseguito l'analisi CSD lungo gli alberi singoli usando l'equazione di CSD determinato, l'oscillazione è visibile solo nella posizione originale. E: Analisi di densità spettrale di potenza di LFP (sinistra, rosso) e tracce CSD (a destra, blu) di registrazione siti 4 sulla tibia I (linea tratteggiata) e II (linea continua). Si noti che CSD analisi isolati correttamente l'oscillazione locale 40 Hz sulla tibia che i, mentre la LFP segnale contiene attività di notevole oscillazione volume-condotto sulla tibia II. PSD analisi è stata effettuata utilizzando la funzione pwelch di MATLAB. F: Aumentando la distanza tra i siti di registrazioni su singoli tibia a 400 µm risultati in una ridotta capacità di analisi CSD per isolare attività focale. Simulazione e l'analisi è stata eseguita utilizzando MATLAB 7.10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57714/57714fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

Questo protocollo descrive la registrazione dei potenziali di campo locale con Multi-Tibia punte in silicio lineare. Conversione dei segnali mediante analisi di densità di corrente sorgente consente la ricostruzione dell'attività elettrica locale nell'ippocampo del mouse. Con questa tecnica, le oscillazioni nello spazio limitato del cervello possono essere studiate in topi liberi di muoversi.

Registrazione spazialmente limitate oscillazioni nell'ippocampo dei topi di comportarsi

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

recording-spatially-restricted-oscillations-hippocampus-behaving

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Views.  University of Freiburg. Questo protocollo descrive la registrazione dei potenziali di campo locale con Multi-Tibia punte in silicio lineare. Conversione dei segnali mediante analisi di densità di corrente sorgente consente la ricostruzione dell'attività elettrica locale nell'ippocampo del mouse. Con questa tecnica, le oscillazioni nello spazio limitato del cervello possono essere studiate in topi liberi di muoversi.

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Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

Derivazione di precursori gliali limitati dalla E13 topi

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Ricerca

Neuroscienze

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Su larga scala di registrazione dei neuroni da sonde mobili in silicio Comportarsi Roditori

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the centrolateral/parafascicular; Cl/Pf nucleus). The activation of either the PPN or Cl/Pf nuclei in vivo has been described to induce the arousal of the animal and an increment in gamma band activity in the cortical electroencephalogram (EEG). The cellular mechanisms for the generation of gamma band oscillations in Reticular Activating System (RAS) neurons are the same as those found to generate gamma band oscillations in other brains nuclei. During current-clamp recordings of PPN neurons (from parasagittal slices from 9 - 25 day-old rats), the use of depolarizing square steps rapidly activated voltage-dependent potassium channels that prevented PPN neurons from being depolarized beyond -25 mV.
Injecting 1 - 2 sec long depolarizing current ramps gradually depolarized PPN membrane potential resting values towards 0 mV. However, injecting depolarizing square pulses generated gamma-band oscillations of membrane potential that showed to be smaller in amplitude compared to the oscillations generated by ramps. All experiments were performed in the presence of voltage-gated sodium channels and fast synaptic receptors blockers. It has been shown that the activation of high-threshold voltage-dependent calcium channels underlie gamma-band oscillatory activity in PPN neurons. Specific methodological and pharmacological interventions are described here, providing the necessary tools to induce and sustain PPN subthreshold gamma band oscillation in vitro.

The pedunculopontine nucleus (PPN) is located in the brainstem and its neurons are maximally activated during waking and rapid eye movement (REM) sleep brain states. This work describes the experimental approach to record in vitro gamma band subthreshold membrane oscillation in PPN neurons.

Registrazione Gamma banda oscillazioni Pedunculopontine Nucleo neuroni

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Construction of an Improved Multi-Tetrode Hyperdrive for Large-Scale Neural Recording in Behaving Rats

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems neuroscience. One key component of this technique consists of the precise placement of multiple electrodes into desired brain regions and the maintenance of their stability. Here, we describe a protocol for the construction of a 3D-printable hyperdrive, which includes eighteen independently adjustable tetrodes, and is specifically designed for in vivo extracellular neural recording in freely behaving rats. The tetrodes attached to the microdrives can either be individually advanced into multiple brain regions along the track, or can be used to place an array of electrodes into a smaller area. The multiple tetrodes allow for simultaneous examination of action potentials from dozens of individual neurons, as well as local field potentials from populations of neurons in the brain during active behavior. In addition, the design provides for simpler 3D drafting software that can easily be modified for differing experimental needs.

We present the construction of a 3D-printable hyperdrive with eighteen independently adjustable tetrodes. The hyperdrive is designed to record brain activity in freely behaving rats over a period of several weeks.

Costruzione di un Hyperdrive multi-tetrodo migliorata per la registrazione su larga scala neurale nel comportarsi ratti

Monitoring the activity patterns of a large population of neurons over many days in awake animals is a valuable technique in the field of systems ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

A lungo termine conflitto sensoriale a comportarsi liberamente topi

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording

The study of synaptic plasticity in the hippocampus has focused on the use of the CA3-CA1 lamellar network. Less attention has been given to the longitudinal interlamellar CA1-CA1 network. Recently however, an associational connection between CA1-CA1 pyramidal neurons has been shown. Therefore, there is the need to investigate whether the longitudinal interlamellar CA1-CA1 network of the hippocampus supports synaptic plasticity.
We designed a protocol to investigate the presence or absence of long-term synaptic plasticity in the interlamellar hippocampal CA1 network using electrophysiological field recordings both in vivo and in vitro. For in vivo extracellular field recordings, the recording and stimulation electrodes were placed in a septal-temporal axis of the dorsal hippocampus at a longitudinal angle, to evoke field excitatory postsynaptic potentials. For in vitro extracellular field recordings, hippocampal longitudinal slices were cut parallel to the septal-temporal plane. Recording and stimulation electrodes were placed in the stratum oriens (S.O) and the stratum radiatum (S.R) of the hippocampus along the longitudinal axis. This enabled us to investigate the directional and layer specificity of evoked excitatory postsynaptic potentials. Already established protocols were used to induce long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) both in vivo and in vitro. Our results demonstrated that the longitudinal interlamellar CA1 network supports N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor-dependent long-term potentiation (LTP) with no directional or layer specificity. The interlamellar network, however, in contrast to the transverse lamellar network, did not present with any significant long-term depression (LTD).

We used recording and stimulation electrodes in longitudinal hippocampal brain slices and longitudinally positioned recording and stimulation electrodes in the dorsal hippocampus in vivo to evoke extracellular postsynaptic potentials and demonstrate long-term synaptic plasticity along the longitudinal interlamellar CA1.

Studiare la plasticità sinaptica a lungo termine nell'Ippocampo Interlamellar CA1 di Electrophysiological Field Recording

The study of synaptic plasticity in the hippocampus has focused on the use of the CA3-CA1 lamellar network. Less attention has been given to the ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. Adeno-associated viruses (AAVs) are increasingly used to improve understanding of brain circuits and their functions. The AAV-mediated manipulation of specific cell populations and/or of precise molecular components has been tremendously useful to identify new sleep regulatory circuits/molecules and key proteins contributing to the adverse effects of sleep loss. For instance, inhibiting activity of the filamentous actin-severing protein&#160;cofilin&#160;using AAV prevents sleep deprivation-induced memory impairment. Here, a protocol is&#160;described that combines the manipulation of cofilin function in a cerebral cortex area with the recording of ECoG activity to examine whether cortical cofilin modulates the wakefulness and sleep ECoG signals. AAV injection is performed during the same surgical procedure as the implantation of ECoG and electromyographic (EMG) electrodes in adult male and female mice. Mice are anesthetized, and their heads are shaved. After skin cleaning and incision, stereotaxic coordinates of the motor cortex are determined, and the skull is pierced at this location. A cannula prefilled with an AAV expressing cofilinS3D, an inactive form of cofilin, is slowly positioned in the cortical tissue. After AAV infusion, gold-covered screws (ECoG electrodes) are screwed through the skull and cemented to the skull with gold wires inserted in the neck muscles (EMG electrodes). The animals are allowed three weeks to recover and to ensure sufficient expression of cofilinS3D. The infected area and cell type are verified using immunohistochemistry, and the ECoG is analyzed using visual identification of vigilance states and spectral analysis. In summary, this combined methodological approach allows the investigation of the precise contribution of molecular components regulating neuronal morphology and connectivity to the regulation of synchronized cerebral cortex activity during wakefulness and sleep.

This article describes a protocol for the manipulation of molecular targets in the cerebral cortex using adeno-associated viruses and for monitoring the effects of this manipulation during wakefulness and sleep using electrocorticographic recordings.

Registrazione elettrocorticografica delle aree della corteccia cerebrale manipolate utilizzando un virus adeno-associato che prende di mira Cofilin nei topi

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.