Este estudo recebeu apoio financeiro da NINR (F32NR013611). Nós gostaríamos de reconhecer e agradecer os desenvolvedores de AnalyzeSkeleton(2D/3D) e FracLac (Arganda-Carreras et al e Karperien et al, respectivamente) sem que a análise aqui descrita não seria possível.

<ol>
	<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li><li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis.">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection (2013).</li><li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. 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Os autores não têm nada para divulgar.

As células da micróglia são finamente sintonizadas com a fisiologia e patologia dentro de seus domínios-micro e exibir uma gama diversificada de morfologias2 em sutil7,14 e prejuízo bruto8. O uso de protocolos ImageJ faz a quantificação de morfologia microglia acessível a todos os laboratórios como a plataforma e plugins são uma imagem de open source software de processamento. Enquanto o protocolo descrito é focado em processamento de imagem e análise usando este software, a consistência da coleta de dados, validade e confiabilidade começa com excelente IHC e microscopia. Este protocolo é usado para melhorar o binário, esqueleto e representações de contorno de toda fotomicrografias e células únicas, mas não pode tomar o lugar do pobre IHC coloração e microscopia que resulta em baixo contraste, borradas ou distorcidas imagens. Como uma consideração adicional, tenha cuidado para não achatar o tecido cerebral durante o armazenamento, antes do corte, o que altera irrevogavelmente microglia morfologia. Por último, dentro de cada experimento, microglia deve ser fotografada usando a mesma escala, bem como o mesmo microscópio. Instrumentação, objectivos e software variam entre microscópios que resultará em diferentes tamanhos fotomicrografias apesar de objectivos semelhantes e mudar os detalhes, bem como o número de células dentro de cada quadro. Por exemplo, aquisição de imagem usando um objectivo X 40 em uma Leica SPII resulta em duas vezes o número de células e menos detalhes do que usando um Zeiss 880 de aquisição. Isto é particularmente importante célula ramificação da recolha de dados de todo o quadro, ao invés de uma única célula, como isto se torna uma questão de amostragem de dados.
Em geral, análise de esqueleto que utiliza a Fotomicrografia toda precede a análise fractal única célula por dois motivos. Ramificação de célula determinante de todas as células em uma Fotomicrografia é rápida quando comparada à análise fractal de célula única e pode ser considerado como uma ferramenta de rastreio, se o tempo é um fator. Além disso, as imagens binárias derivadas durante a análise do esqueleto são utilizadas para análise fractal. Uma vez que a criação da imagem, há uma série de passos críticos que podem influenciar os resultados da análise de esqueleto e introduzir o usuário-influência. As etapas de protocolo que são a maioria das variáveis entre usuários estão etapa 4.2 (brilho crescente da imagem) em 4.5 (determinação do limiar). Sempre que possível, um número ideal para aumentar a luminosidade (max ou min controle deslizante entre 0-255) é determinado e mantido constante para todos os usuários e imagens. Onde a variabilidade de imagem é grande, o usuário pode escolher em vez de um brilho que pode variar entre imagens. Como alternativa, se as imagens são brilhantes e contraste é alta, então aumentar o brilho pode ser omitido e limiarização pode ser padronizada, usando um filtro de limiar de especialidade (ex., Huang) em vez do padrão mais variável. Uma vez otimizado, os parâmetros devem ser observados a fim de minimizar a influência-usuário adicional.
Um exemplo de variabilidade de usuário é apresentado na Figura 5. Valores de dados foram aumentados em usuário 1 contra 2 do usuário e, portanto, variabilidade seria aumentada se tanto usuário 1 e 2 do usuário contribuíram para a coleta de dados. Um exemplo das diferenças no usuário 1 e 2 do usuário binárias e esqueletizadas imagens são destacados por círculos coloridos (Figura 5). Neste caso, ambos os usuários foram brevemente treinados estudantes com experiência limitada no microglia. Supervisão regular e orientação por um microglia perito juntamente com protocolo maior formação2 podem reduzir a variabilidade inter-user. Embora não avaliados aqui, análise fractal é menos sujeito a variabilidade inter usuário porque células binárias são manualmente e individualmente isoladas uma Fotomicrografia ao invés de depender exclusivamente de limiarização para determinar formas de micróglia. No entanto, todos os métodos possuem uma variabilidade entre os usuários. Portanto, um único usuário (idealmente, treinado por alguma experiência nas células da microglia) deve concluir a coleta de dados para um dataset inteiro.
Modificações adicionais podem ser facilmente feitas ao presente protocolo e dependerão a qualidade da imagem e os esforços desenvolvidos para reduzir o ruído e garantir a ligação de processo. Por exemplo, se o contraste for adequada, máscara de nitidez não é necessária e pode ser omitida. É prudente otimizar e finalizar o protocolo para um conjunto específico de imagens, ambos os casos experimentais e controles, antes da coleta de dados de um conjunto inteiro. Por fim, plugins adicionais pode ser usado no lugar de outros para clarificar ou aguçar imagens que não foram descritas no presente protocolo como dilatar ou aguçar.
Vantagens do presente protocolo são sua disponibilidade universal e adaptabilidade. Além disso, avaliar a ramificação de célula usando AnalyzeSkeleton é rápida e aplicável a uma Fotomicrografia inteira. Uma vantagem da abordagem de análise de várias células é o foco de toda uma região, ao invés de células únicas. Portanto, é possível avaliar rapidamente a ramificação média (em termos de pontos de extremidade e comprimento de processo) de micróglia todos dentro da imagem. Análise de esqueleto fornece uma análise de várias células: uma amostragem de dados em termos de números de celular que não podem ser igualadas por análise fractal devido o investimento de tempo necessário para isolar células únicas de fotomicrografias. Uma instância que possa ser mais adequado seria no rastreio microglia morfologias nas proximidades de uma lesão focal. Uma limitação é o processamento de imagem de todo campo para criar modelos de esqueleto de fotomicrografias IHC é imperfeito quando comparado com a abordagem única célula mais demorada. Além disso, uma análise da região não é adequada às circunstâncias onde morfologias microglia são drasticamente diferentes dentro do mesmo campo. Por último, este método de análise é dependente da contagem de células, um parâmetro que pode ser diferente entre as condições experimentais.
Análise fractal é realizado em uma única célula e, portanto, complementa a saída de dados de ramificação de célula média resultante da análise de esqueleto. Embora muito mais demorada, este investimento produz uma ampla gama de dados morfométricos. Por exemplo, célula de densidade, relação de extensão, e dados de circularidade descrevem o tamanho, alongamento e forma de contorno da célula, respectivamente. Lacunarity e dimensão fractal resumem a célula complexidade e heterogeneidade de forma, respectivamente. É fornecido um resumo mais profundo de como cada parâmetro é calculado e como os dados podem ser interpretados no manual interativo16 e tal detalhe deve ser considerado em relação à questão específica de pesquisa. O protocolo descrito resulta em sensíveis ferramentas para quantificar pequenas mudanças em 2D microglia morfologias que podem ocorrer em condições fisiológicas e patológicas. Análise morfométrica adicionais como solidez, convexidade e fator de formulário16,20 pode ser possível se gerando formas 3D.
Adaptação e desenvolvimento de protocolo é contínuo e controlado pelo usuário. Isso foi estendido de fluorescência8 DAB/brilhante-campo imagens7 , mas ainda não tecido incorporado de parafina. -Além disso, pode ser usada em conjunto com software proprietário como hottie para análise adicional. Este protocolo pode ser aplicado a uma variedade de Fisiologia e não está limitado a microglia, mas pode ser aplicado a qualquer célula ou tecido com padrões particulares ou formas que podem ser identificadas usando métodos IHC. Por último, com tamanho de amostra suficiente, uma análise multivariada ou cluster pode ser aplicada para estratificar microglia de acordo com a morfologia de12,21; Isto é informações significativas como morfologia microglia é um indicador vital da microglia funções e respostas a seus arredors. O apreço pela diversidade morfológica microglial é importante para compreender inteiramente interações neurônio-glia-vascular durante a saúde e a doença e em expansão. Crescimento neste campo é reforçado por protocolos bem desenvolvidos, fácil de usar e pode ser reproduzidos para quantificar e resumir microglia morfologia usando múltiplas variáveis contínuas.

Microglia têm uma resposta morfológica imediata e diversa alterações no cérebro fisiologia1 ao longo de um continuum de possibilidades que variam de hiper-ramificação e altamente complexas morfologias a eliminação ramificadas e ameboides morfologias2 . Microglia também pode tornar-se polarizada e de forma cilíndrica3. Ramificação de célula microglia é comumente definida como uma forma complexa, tendo vários processos e muitas vezes é relatada como o número de pontos de extremidade por célula e a duração dos processos celulares. Desde microglia são finamente ajustados a função neuronal e glial através do celular contínua cross-talk e na vivo motilidade4,5, microglia morfologias podem servir como indicadores de célula diversas funções e disfunções no cérebro. Uma abordagem quantitativa é necessária para descrever adequadamente a diversidade dessas alterações morfológicas e de distinguir as diferenças entre células ramificadas que ocorrem com sutis perturbações fisiológicas (como epilepsia5,6 e concussão7) Além de prejuízo bruto (tais como acidente vascular cerebral8). Um aumento da utilização de morfologia quantificação7,8,9,10,11,12,13,14 revelará a completa diversidade de morfologias microglia durante saúde e doença. O presente estudo detalhes o uso gradual do ImageJ plugins necessários para resumir microglia morfologia de fotomicrografias fluorescentes ou não-fluorescente de micróglia adquirido em tecido de roedor fixo depois de imuno-histoquímica (IHC).
Central para as técnicas de análise descritas aqui são o ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, desenvolvido em 2010 para quantificar a grandes estruturas mamárias e FracLac16, desenvolvido em 2014 para integrar a análise ImageJ e fractal para quantificar as formas individuais microglia. Esses plugins fornecem uma análise rápida da microglia ramificação dentro fotomicrografias inteiras ou microglia múltiplas de um ROI definido dentro uma Fotomicrografia. Esta análise pode ser usada sozinho ou em complemento com análise fractal. A análise fractal de célula única (FracLac) requer um investimento de tempo, mas fornece várias saídas de morfologia em relação a tamanho, forma e complexidade microglia. O uso de ambas as ferramentas não é redundante, como célula ramificação é complementar à complexidade da célula, e a combinação de vários parâmetros pode ser utilizada para distinguir microglia diversas morfologias dentro de conjuntos de dados12,17.

<table><tbody><tr><td>primary antibody anti-IBA1</td><td>Wako&amp;nbsp;</td><td>019-19741</td><td>rabbit host</td></tr><tr><td>Vectashield soft mount</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>donkey host</td></tr><tr><td>4 mL glass vial</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

Microglia são os fagócitos de cérebro que continuamente seu ambiente por doença, lesão e disfunção de vistoria e participarem na homeostase do cérebro. Como as socorristas, microglia têm funções importantes para atenuar a disfunção do neurônio e glia, e nesse processo, passam por uma ampla gama de alterações morfológicas. Microglia morfologias podem ser categorizadas de forma descritiva ou, alternativamente, podem ser quantificadas como uma variável contínua para parâmetros como ramificação de célula, complexidade e forma. Enquanto métodos para quantificar a microglia são aplicados a células únicas, algumas técnicas se aplicam a microglia múltiplos em uma Fotomicrografia inteira. A finalidade desse método é quantificar múltiplo e única células usando protocolos ImageJ prontamente disponíveis. Este protocolo é um resumo das etapas e plugins ImageJ recomendado para converter fotomicrografias de fluorescência e brilhante-campo em imagens binárias e esqueletizadas representante e analisá-los usando o software plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) e FracLac morfologia recolha de dados. As saídas desses plugins resumem morfologia celular em termos de pontos de extremidade do processo, junções e comprimento, bem como complexidade, forma da célula e descritores de tamanho. O protocolo de análise esqueleto aqui descrito é bem adequado para uma análise regional de micróglia múltiplos dentro de uma Fotomicrografia toda ou a região de interesse (ROI), Considerando que FracLac fornece uma análise complementar célula individual. Combinado, o protocolo fornece um objetivo, uma ferramenta de avaliação sensível e abrangente que pode ser usada para estratificar entre microglia diversas morfologias presentes no cérebro saudável e ferido.

Os protocolos de análise de morfologia microglia aqui descritos resumem passos útil no processamento de lâmpadas fluorescentes e DAB fotomicrografias para Análise morfométrica. Visualmente, estas etapas são resumidas na Figura 2 e Figura 3. O objetivo dessas etapas é criar uma imagem representativa de binária e esqueletizada que modela adequadamente a Fotomicrografia original, tal que os dados acumulados são válidos. Após a aplicação do protocolo, o plugin AnalyzeSkeleton resulta em uma imagem do esqueleto marcada do que o número de pontos de extremidade e filial (i. e., processos) lengthcan ser resumido de arquivos de saída resultante. Pontos de extremidade e processar dados de comprimento são usados para estimar a extensão da microglia ramificação na Fotomicrografia ou ROI. A Figura 4 resume os dados resultantes (comprimento/célula/célula de pontos de extremidade e processo) coletados com e sem a aplicação do protocolo. Embora existam tendências similares, os dados resumidos na Figura 4F são menos variável do que aqueles em Figura 4E. Além disso, esses dados ilustram o aumento da sensibilidade para detectar diferenças entre os grupos quando o protocolo é aplicado. Por último, deve ter cuidado sobre variabilidade inter usuário na aplicação do protocolo. Tais diferenças são resumidas pela Figura 5 , onde o mesmo conjunto de dados foi analisado por dois usuários independentes aplicando um protocolo idêntico como resumidos acima.
Morfologia adicionais dados são coletados de simples células isoladas a partir das imagens binárias criadas durante a aplicação do protocolo. As etapas do protocolo para analisar a morfologia microglia antes e usando o plugin FracLac estão resumidos na Figura 6. Podemos ilustrar esta análise em ambos ilesos (figura 6A) e ferido o tecido (Figura 6B). Imagens representativas de binário, esboçado, convexo de casco/encapsular círculo e exemplos de contagem de caixa para cada célula analisados com e sem o protocolo de aplicação são mostrados na Figura 6–F. Estas imagens ajudam a ilustrar as origens das diferenças nos dados de morfologia quais são resumidas na Figura 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> Figura 1. Ilustrações de esqueletizada microglia com uma soma circular (qualidade inferior) versus uma soma de origem única (ideal) e a correspondente sobreposição entre a célula esqueletizada e a original Fotomicrografia. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> Figura 2. Protocolo de aplicativo para fluorescentes fotomicrografias. Ilustrações do protocolo esqueleto análise aplicada a uma Fotomicrografia fluorescente com uma única célula cortada para mostrar os detalhes. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> Figura 3. Aplicação de protocolo para campo claro DAB fotomicrografias. Ilustrações do esqueleto análise protocolo aplicado a uma Fotomicrografia DAB brilhante-campo com uma única célula cortada para mostrar os detalhes. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> Figura 4. Análise de dados com e sem a aplicação do protocolo. (A) uma fotomicrografia de exemplo de IHC fluorescente e recortada célula que corresponde a caixa amarela em (B). Imagens de exemplo binárias e esqueletizadas com (C) e sem (D), o protocolo aplicado conforme descrito. Dados de Resumo de micróglia pontos de extremidade/célula e processo comprimento/célula em ileso (branco) e feridos (cinza) tecido cortical com (E) e sem (F), o protocolo aplicado. Análise estatística utilizando o teste t de student e n = 3, * * denota p < 0,01. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> Figura 5. Diferenças do usuário com a aplicação do protocolo. Um exemplo de uma conversão de imagem e protocolo original para imagens binárias e esqueletos pelo usuário 1 e 2 do usuário. Diferenças entre as duas imagens são realçadas com correspondência de círculos coloridos. Gráficos de Resumo de dados de comprimento/célula/célula de pontos de extremidade e processo microglia em regiões do cérebro ileso e feridos pelo usuário 1 e 2 do usuário. Análise estatística com ANOVA e amostra tamanho é n = 3; p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001. Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> Figura 6. Análise fractal com e sem a aplicação do protocolo. Exemplo de fotomicrografias recortadas da microglia no ileso (A) e feridos (B) córtex com binário correspondente (C) e imagens de estrutura de tópicos (D) que resultam com e sem o protocolo aplicado. A superfície convexa associada (azul) e encerrando o círculo (rosa) para formas de contorno correspondente (E) são usados para calcular a densidade de forma, proporção e circularidade (G) de calibração. A caixa contando método é ilustrada em (F) e usada para cálculos de lacunarity (λ) (G) e a dimensão fractal (DB). Barra de escala = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia são células imunes do cérebro que pesquisa e reagem a fisiologia do cérebro alteradas através de alterações morfológicas que podem ser avaliadas quantitativamente. Este protocolo descreve um ImageJ com base em protocolo de análise para representar microglia morfologia como dados contínuos de acordo com métricas como ramificação de célula, complexidade e forma.

Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

66.4K visualizações.  University of Arizona. Microglia são células imunes do cérebro que pesquisa e reagem a fisiologia do cérebro alteradas através de alterações morfológicas que podem ser avaliadas quantitativamente. Este protocolo descreve um ImageJ com base em protocolo de análise para representar microglia morfologia como dados contínuos de acordo com métricas como ramificação de célula, complexidade e forma.

Vídeo: Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Bioengenharia

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Uma imersão Ensaio: Um protocolo para avaliar Interações entre CNS fagócitos e Neurônios

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Neurociência

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Medicina

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Dois Algoritmos para métodos de alta capacidade e Multi-paramétrico Quantificação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Junção Neuromuscular Morfologia

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either fluorescence detection approaches, such as immunofluorescent staining or transfection with fluorescent proteins or edge detection techniques, which are often error-prone due to noise and other non-idealities in the image background. 
We designed a new algorithm that could accurately count and distinguish macrophages and fibroblasts, cells of different phenotypes that often colocalize during tissue regeneration. MATLAB was used to implement the algorithm, which differentiated distinct cell types based on differences in height from the background. A primary algorithm was developed using an area-based method to account for variations in cell size/structure and high-density seeding conditions. 
Non-idealities in cell structures were accounted for with a secondary, iterative algorithm utilizing internal parameters such as cell coverage computed using experimental data for a given cell type. Finally, an analysis of coculture environments was carried out using an isolation algorithm in which various cell types were selectively excluded based on the evaluation of relative height differences within the image. This approach was found to accurately count cells within a 5% error margin for monocultured cells and within a 10% error margin for cocultured cells.

We present a method, which utilizes a generalizable area-based image analysis approach to identify cell counts. Analysis of different cell populations exploited the significant cell height and structure differences between distinct cell types within an adaptive algorithm.

Algoritmo de análise de imagem baseado em área para quantificação de coculturas de macênfago-fibroblasto

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

Imunofluorescência Manchausando IBA1 e TMEM119 para densidade microglial, morfologia e análise periférica de infiltração de células mieloides no cérebro do rato

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Imunologia e Infecção

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Ensaios baseados em citometria de fluxo para engolfamento microglial de materiais sinápticos

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

Autor em destaque: Avançando a compreensão por meio de inovações tecnológicas em psiconeuroimunologia

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

Quantificação do engolfamento microglial de material sináptico usando citometria de fluxo

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Quantificar a Microglia morfologia de fotomicrografias de imuno-histoquímica preparado tecido usando o ImageJ

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Quantificação do engolfamento microglial de material sináptico usando citometria de fluxo

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