Os autores Obrigado Linnea Tankred e Diana Rydholm para criação de animais.

Filhotes de rato BALB/c, de ambos os sexos foram utilizados em conformidade com a instrução para o uso de animais em oftalmológico e Vision Research, e os protocolos foram aprovados pela Comissão de Estocolmo para a ética Animal de investigação. Os ratos foram alojados em ninhadas, juntamente com a mãe que amamenta, com um ciclo de dia/noite de 12 h, livre acesso à comida e água e monitorados diariamente.
Nota: Para o procedimento cirúrgico, os ratos foram mantidos sob anestesia com isoflurano voláteis. Pomadas oculares são desencorajadas durante procedimentos oculares, como eles podem interferir com tratamentos e substâncias utilizadas. Se necessário, para evitar o olho seco, uma gota de solução salina normal estéril pode ser aplicada. Apesar da Úvea punções são self-healing, cuidado foi tomado durante punções da Úvea para garantir a esterilidade com instrumentos cirúrgicos. Tratamento pós-cirúrgico incluiu a hidratação com solução salina normal por via subcutânea e analgesia com a administração tópica ocular de cloridrato de tetracaína. Os filhotes foram autorizados a recuperar a prostração esternal sobre uma almofada de aquecimento antes de ser devolvido para a mãe que amamenta, em uma gaiola limpa. Ninhadas foram mantidas com a mesma mãe de enfermagem para evitar o estresse.
1. anestesia
<ol><li>Prepare a câmara de indução de anestesia, para administrar o isoflurano anestésico e certifique-se de que uma máscara pequena do mouse também é acoplada. Nota: Realize experimentos todos os animais de acordo com todas as licenças éticos aplicáveis.</li>
	<li>Prefill câmara de indução com 3-4% de isoflurano voláteis no ar atmosférico. Nota: Diferentes substâncias anestésicas que isoflurano podem ser utilizadas, de acordo com autorizações de éticas. Procedimentos anestésicos voláteis devem ser realizados uma campânula ventilada de banco ou emanações.</li>
	<li>Coloca um filhote de rato BALB/c de 12,5-dias de idade pós-natal (P) na câmara de indução. Confirme que o aparelho de anestesia está pronto para entregar isoflurano para a câmara de indução. Nota: Filhotes de rato são frágeis e melhor manipulado pela nuca. Manter os filhotes juntos como uma ninhada ou com a mãe de enfermagem para evitar o estresse.</li>
	<li>Permitir que o filhote ser totalmente anestesiado.</li>
	<li>Delicadamente, pega o filhote de rato pela nuca. Nota: Manter a câmara de indução fechada em todos os momentos para indução segura e estável.</li>
	<li>Transferi o mouse para a máscara de roedor. Certifique-se de mudar o fluxo anestésico da câmara de indução para a máscara ao mover o mouse.</li>
	<li>Execute uma pitada de dedo do pé para confirmar a anestesia.</li>
</ol>2. perfure o procedimento sob estereoscópio cirúrgico
<ol><li>Posicione o mouse na posição lateral de prostração. Confirme que a máscara está bem posicionada para que o olho do rato é no campo de visão do estereoscópio.</li>
	<li>Assim que o olho está virada para cima em direção ao estereoscópio, Rode suavemente a cabeça de rato. Nota: O foco claro do olho deve ser alcançado sob o estereoscópio. Posicionamento, é recomendável uma ampliação de 16x, enquanto 40 X deve ser usado para realizar o procedimento cirúrgico. Se ética autorizações permitem, aparar a ponta dos bigodes pode facilitar a visualização do olho.</li>
	<li>Usando pequenas pinças subordinante, cuidadosamente se projetam olho do filhote aplicando uma pressão para baixo para as pálpebras, dorsais e ventrais ao olho.</li>
	<li>Segure um suave mas firme da tampa do olho do filhote, com pequenas pinças. Nota: Recomenda-se realizar a protusão do olho e tampa segurando com a mão não dominante, como a mão dominante deve executar o procedimento de punção.</li>
	<li>Use o estereoscópio para localizar ao limbo da córnea. Limbo de Albino BALB/c pode ser facilmente identificado, o plexo vascular circular posterior da córnea.</li>
	<li>Com uma agulha chanfrada de diâmetro (30 G) de 0,25 mm, realize uma pequena punção da Úvea, perto do limite de estroma posterior da Úvea. Use apenas a ponta da agulha, e não mais da metade do bisel (equivalente a 0,5 mm), punção da Úvea. Se executado corretamente, os furos da Úvea são auto-selante, ainda injeção intra-ocular de substâncias de estudo pode ser administrada através do mesmo ferimento. Nota: Se experimentou com anatomia ocular do mouse, a punção da Úvea é executada entre o corpo ciliar e ora serrata. Deve ter cuidado ao executar a punção da Úvea para evitar a ruptura da lente.</li>
	<li>Realize a punção da Úvea segunda no site do oposto do olho do primeiro local de punção. Otimizar a distância e a posição das punções; Considere o 12 e punções de 06:00, com 12:00 sendo tão dorsal quanto possível.</li>
	<li>Repita o procedimento de punções da Úvea em quatro dias até P24.5. Antes de cada punção da Úvea sucessiva, monitore animais status especial atenção à presença da catarata traumática devido a dano da lente durante a punção da Úvea, ou pressão ocular diminuição óbvia. Aponte para executar punções repetição às mesmas posições como punções anteriores para efeitos de ideais.</li>
</ol>3. não-invasiva na Vivo de monitoramento
<ol><li>Antes da punção ou injeções em cada dia experimental, anestesia o mouse como realizada acima.</li>
	<li>Com o mouse na posição lateral de prostração, projetam-se suavemente o olho.</li>
	<li>Concentre-se na vasculatura de íris com o estereoscópio cirúrgico.</li>
	<li>Tire uma foto da vasculatura íris com uma câmera equipada para o estereoscópio cirúrgico. Nota: Apesar de não haver necessidade, induzindo a meiose pode ser útil para normalizar a área de íris por animal. Considere éticas licenças quando selecionando um agente indutor de meiose. Cuidado foco da vasculatura íris facilitará ainda mais a análise quantitativa. Recomenda-se uma magnitude de 40 X.</li>
</ol>4. no pós-operatório cuidados
<ol><li>Remover o filhote BALB/c da máscara de roedores e suavemente, transferi-lo para uma almofada de aquecimento em camadas com uma esteira cirúrgica.</li>
	<li>Aplique uma gota de solução de tetracaína 1% aos olhos perfurados. Nota: Outras soluções analgésicas podem ser usadas, de acordo com autorizações de éticas.</li>
	<li>Hidrate o animal com uma injeção subcutânea de 200 µ l de solução salina normal estéril.</li>
	<li>Retorne o filhote para a mãe que amamenta em uma gaiola limpa do mouse.</li>
	<li>Monitore o processo de recuperação. O filhote deve ser capaz de deambulate e voltar para a maca.</li>
</ol>5. olho Enucleação
<ol><li>Eutanásia do animal por deslocamento cervical. Execute Enucleação e dissecação sob um estereoscópio para melhor visualização do procedimento. Nota: Os procedimentos de eutanásia diferentes podem ser usados. Recomenda-se a aderir às autorizações de éticas.</li>
	<li>Separe as pálpebras para melhorar a exposição aos olhos.</li>
	<li>Fazer um pequeno corte (cerca de 0,5 cm) perto do canto do olho das pálpebras com uma tesoura de olho Bonn curva.</li>
	<li>Use o espaço periocular expostas para inserir micro fórceps subordinante atrás (do globo sob) na órbita.</li>
	<li>Pegue o tecido circundante do olho e puxe delicadamente para cima. Evitar a exploração sobre o globo ocular, usar os tecidos circundantes mais próximo ao soquete do olho.</li>
	<li>Inserir a tesoura de olho Bonn curva atrás do globo do olho na órbita.</li>
	<li>Corte os tecidos circundantes, até que o olho é liberado do soquete. Nota: Esta técnica de dissecação mantém a anatomia do olho e beneficia a análise subsequente.</li>
	<li>Proceda à remoção do tecido externos do olho. A remoção de tecido estranho pode ser executada após a fixação, se preferirem. Nota: Camundongos BALB/c são melanina deficiente, portanto, para aumentar o contraste, é recomendado um fundo escuro para facilitar o processo de dissecação.</li>
	<li>Brevemente enxaguar o olho inteiro em uma placa de Petri preenchida com solução salina tampão fosfato (PBS).</li>
	<li>Transfira o olho para um tubo de 2 mL contendo 1,5 mL de solução de formol tamponado de 4%.</li>
	<li>Fixar o olho durante 6 h à temperatura ambiente. Nota: Fixação confere a rigidez do tecido e facilita a dissecação da íris. Tempo de fixação deve ser testado e ajustado para diferentes aplicações.</li>
</ol>6. Iris dissecação procedimento sob estereoscópio
<ol><li>Remover a solução fixador do tubo com uma pipeta Pasteur plástica de 1,5 mL (ou similar) e enxágue os olhos três vezes com PBS fresco.</li>
	<li>Coloque o olho fixo em uma superfície lisa seca (carrinho de dissecação) com câmara anterior voltado para cima.</li>
	<li>Com uma agulha 30G chanfrada, realize um ponto de entrada posterior ao limbo.</li>
	<li>Segurando o segmento anterior com pequenas pinças subordinante, insira uma ponta do Clayman-Vannas para reta na abertura criada anteriormente. Nota: Recomenda-se controlar a pinça com a mão não dominante e a tesoura com o dominante.</li>
	<li>Enquanto roda o olho com a pinça subordinante, corte em torno ao limbo para remover o segmento posterior do olho. Nota: Efectuar cortes parciais permitirá a ponta interna da tesoura para continuar no tecido e grandemente facilita o processo.</li>
	<li>Posicione o segmento anterior voltada para baixo, expondo a lente.</li>
	<li>Remova a lente cuidadosamente agarrando-o com pequenas pinças e puxando para cima. Nota: Uma agulha chanfrada pode ser usada para perfurar e puxe a lente.</li>
	<li>Posicione o segmento anterior com a córnea virado para baixo e o corte perpendicular ao campo de visão.</li>
	<li>Pegue delicadamente o tecido posterior ao corpo ciliar com a pequena pinça subordinante.</li>
	<li>Com uma tesoura reta Clayman-Vannas, prosseguir para aparar só anterior do corpo ciliar para remover a malha trabecular e isolar a íris. Confirmar que a malha trabecular é removida; a íris deve mover-se dentro da córnea.</li>
	<li>Transferi com cuidado a viseira anterior com a pinça subordinante pequena, mantendo a córnea, a uma placa de 96 poços contendo 200 µ l de PBS.</li>
	<li>Continue a manter a córnea no poço e dissecar a íris por lavagem com PBS com uma pipeta. Nota: Se o aderente de restos de íris para a córnea, uma malha trabecular pode estar presente e o bisel da agulha 30G pode ser usado para ajudar a deslocar a íris.</li>
	<li>Retire o 96 poços com a pequena pinça subordinante da córnea e manter a íris isolada no poço para uma análise mais aprofundada.</li>
	<li>Armazenar amostras flutuantes íris a 4 ° C. Nota: Apesar de ser corrigido, armazenamento a longo prazo das amostras flutuantes íris não é recomendado.</li>
</ol>7. possíveis leituras experimentais
<ol><li>Para visualizar os vasos sanguíneos em íris dissecados, use toda a montagem flutuante imuno-histoquímica coloração métodos para marcadores como a molécula de adesão celular endotelial de plaquetas (PECAM) -1 ou isolectin B4. Como alternativa, use perfusão de todo o corpo com manchas vasculares, tais como dextranos fluorescente-etiquetadas alto peso molecular.</li>
	<li>Use na vivo não invasiva imagens para realizar em silico plana-montagem e quantificar a vasculatura íris completo com software de imagem apropriado. Nota: O sistema vascular pode ser quantificada, tanto in vivo e em vitro, utilizando densitometria ou com vasculatura análise software9.</li>
	<li>O processo todo globo ocular para ácidos nucleicos e extração da proteína, seguido por métodos PCR ou immunoblotting, realizar a análise molecular dos olhos perfurados. Nota: Análise Molecular dos tecidos é melhor executada com tecido não fixa, mas dissecação da íris não fixa é extremamente desafiador, e o uso do olho todo tem processado resultados estatisticamente significativos em anteriores estudos8.</li>
</ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Rubeosis+Iridis+Induced+by+Intravitreal+Latex-derived+Angiogenic+Fraction.">Rabbit Rubeosis Iridis Induced by Intravitreal Latex-derived Angiogenic Fraction.</a> Curr Eye Res. 36 (9), 857-859 (2011).</li><li>Takei, A., Ekstr&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+of+Prolyl+Hydroxylase+Domain+2+Inhibits+Hypoxia-inducible+Angiogenesis+in+a+Model+of+Choroidal+Neovascularization.">Gene Transfer of Prolyl Hydroxylase Domain 2 Inhibits Hypoxia-inducible Angiogenesis in a Model of Choroidal Neovascularization.</a> Sci Rep. 7, 42546 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

No presente protocolo, é apresentado um novo método para a indução da resposta vascular de íris por punção da Úvea. A punção desencadeia mecanismos de cura ferida e promove respostas vasculares na íris10,11. Isto está de acordo com patologias oculares, tais como o PDR e NVG, onde respostas angiogênico exacerbada da retina no segmento posterior do olho culminaram com o quadro clínico da rubeosis iridis, uma aumento de vascularização da íris12 ,13.
A córnea é avascular e possui uma estrutura peculiar colágeno resultando em transparência. Dessa forma, angiografia do segmento anterior do olho para visualização da vasculatura íris é alcançável pela visualização direta de vasos sanguíneos de íris com vivo métodos não-invasivos13,e14. Anteriores modelos animais de neovascularização íris baseou-se em animais grandes olhos onde complexas intervenções cirúrgicas foram realizadas15,16,17, ou por injeção intra-ocular de substâncias específicas angiogênico 18 , 19. neste método, o uso de ratos BALB/c deficientes pigmento permite observação direta do íris vasculatura na vivoe permite a quantificação não-invasiva de neovascularização da íris em camundongos, proporcionando assim uma nova ferramenta para estudar vivo em angiogênese.
Além disso, o método apresentado para dissecação de íris do mouse permite a análise de neovascularização íris induzida por punção com marcadores específicos vasculares. Aqui, íris navios illustratively foram corados com PECAM-1 anticorpos e visualizados por microscopia de fluorescência. Protocolos de imunocoloração flutuantes, toda a montagem são facilmente alcançados e bastante rotineira. Além disso, métodos de perfusão para os vasos sanguíneos podem ser executados neste modelo. Coloração específica vascular concede a avaliação da estrutura dos vasos sanguíneos de íris e, assim, a quantificação, do usuário-baseado ou software de análise, da íris neovasculature9. Como descrito anteriormente8,20, a ilustração da íris neovasculature foi avaliada no dia 15 pós-puncture-indução. No entanto, efeitos na vascularização da íris podem ser observados logo em dia 4 post-puncture-indução, sugerindo que a avaliação do modelo de neovascularização íris induzida por punção poderia realizar-se em pontos de tempo diferentes, com base em específico requisitos de experimentais.
Vale ressaltar ao estado que este protocolo apresenta alguns desafios, especialmente relacionados com o tamanho de um olhos de ratos em relação ao outro modelo animal. Extremo cuidado deve ser tomado ao executar o procedimento de punção da Úvea, para evitar toques de lente ou danos aos olhos. Observação da condição ocular é paramount e animais exibindo catarata relacionada à experimental ou queda na pressão ocular deve ser excluída e sacrificada adequadamente. Íris de mouse são extremamente frágeis e um pouco brega. Adequada dissecção e o isolamento do tecido apresenta mais um passo crítico para o protocolo. Uma correta separação da malha trabecular é necessária para o deslocamento da íris de câmara anterior. Além disso, devido à fragilidade, isolamento da íris requer fixação do tecido, que prejudica a análise molecular a jusante. No entanto, uma análise molecular de todo não fixada-olhos foi aplicada com sucesso para o método apresentado8.
Em resumo, o protocolo descrito apresenta um modelo de mouse de neovascularização íris romance induzida por punção. Este modelo tem a vantagem de permitir na vivo não invasiva visualização directa da angiogênese. Além disso, o uso de pequenos roedores processa o modelo apresentado atraente para estudos de rubeosis iridis, pois evita a utilização de animais de grandes olhos e acompanhado de restrições éticas. Além disso, o procedimento pode ser combinado com injeção de substâncias pro - ou antiangiogênico através da punção Auto-selante, realçando sua utilidade como um novo modelo de angiogênese na vivo .

A íris, juntamente com o corpo ciliar e a coroide, compreende a Úvea, que é o tecido mais vascularizado do olho. Vasculatura Iris é essencial na manutenção da homeostase na câmara anterior do olho. Como resultado de abundantes conexões anastomótica entre artérias e veias, os vasos sanguíneos de íris fornecer nutrientes e o suprimento de oxigênio não só a íris em si, mas o todo segmento anterior do olho1.
A formação de novos vasos sanguíneos, ou angiogênese de pre-existentes, é fundamental em processos fisiológicos, tais como desenvolvimento e2de cicatrização de feridas. Angiogênese é finamente regulada por uma multiplicidade de factores canônicas, como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e inibidor de ativador de plasminogênio (PAI), bem como vários fatores inflamatórios, e um desequilíbrio desses fatores pode levar a patológica angiogênese3.
No olho, a neovascularização é a causa de doenças fatais vista, tais como a retinopatia diabética proliferativa (PDR) e glaucoma neovascular (NVG). Nestas doenças oculares, a neovascularização focal geralmente está localizada em tecidos da retina, no entanto, o desequilíbrio em inflamatória e fatores angiogênico em ambos as anteriores e posteriores oculares câmaras do olho tem sido associada com rubeosis iridis, o termo clínico para íris neoangiogênese patológica4. Estas patologias indicam a capacidade da íris adulta submeter-se a angiogênese. Em camundongos, sistema vascular ocular é imaturo, após o nascimento e continua a maturação pós-parto. Esta peculiaridade do desenvolvimento é explorada no modelo do rato da retinopatia induzida pelo oxigênio, um modelo que imita pròxima o quadro clínico de retinopatia da prematuridade5. Além disso, angiogênese e inflamação desempenham um papel crucial em mecanismos6de cicatrização de feridas, e para ferir a cura em si tem sido associada a angiogênese modelos7.
Neste estudo, descrevemos um modelo de neovascularização íris induzida por punção. Da Úvea punções são realizadas perto do limite exterior do limbo, que induzem a neovascularização da íris por acionar a sistema de cicatrização de feridas. Devido a transparência da córnea, a vasculatura de íris pode ser analisado facilmente na vivo por métodos não-invasivos. Furado olhos apresentam um aumento do leito vascular na íris, que tem sido associada com um aumento da ativação do plasminogênio e marcadores inflamatórios8. O modelo apresentado tem um grande potencial como uma nova ferramenta para estudar a angiogênese e triagem angiogênico compostos e permite a visualização direta no vivo dos processos angiogênico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn eye scissors</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>23060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman-Vannas curved scissors</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>E3383 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman-Vannas straight scissors</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>E3383 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective adapter for camera</td>
			<td>Handcrafted</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Or any system that allows adapting a camera to the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 100-110 watts</td>
			<td>Non Applicable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Available in pet/veterinarian stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic 30g beveled needle</td>
			<td>KDM GmBH germany</td>
			<td>911914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iphone 4S</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Non Applicable</td>
			<td>Or other high resolution image acquistion device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>KDG 9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson tying forceps</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>E1815 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tying forceps</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims tetracaine hydrochloride</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 % (w/v) Eye Drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral-buffered formalin</td>
			<td>Bioreagens</td>
			<td>0018-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline solution</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>210352</td>
			<td>0.9 % (w/v) NaCl in injectable water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Balanced and buffered PBS pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 3 cm</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Seal Tube 2.0 mL</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.685.200</td>
			<td>Or any eppendorf style tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC plate 96-well</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3.5 mL</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td>Or any other Pasteur pipette style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Univentor 400 anesthesia unit</td>
			<td>Univentor Limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild M650 surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Or other surgical or magnifying stereoscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

puncture-induced iris neovascularization as a mouse model of rubeosis iridis

Descrevemos um modelo de neovascularização íris induzida por punção como um modelo geral para avaliação não invasiva da angiogênese. O modelo também é relevante para o direcionamento de glaucoma neovascular, uma visão ameaçadora complicação da retinopatia diabética. Este método baseia-se na indução da resposta vascular de íris por uma série de furos da Úvea autovedante em camundongos BALB/c e aproveita a maturação pós-parto da vasculatura ocular do mouse. Filhotes de rato passam por punções da Úvea do dia pós-natal 12.5, quando os filhotes naturalmente abrirem seus olhos, até o dia pós-natal 24,5. Devido a transparência da córnea, vasculatura íris pode ser analisada facilmente através do tempo por métodos não invasivos na vivo . Além disso, a íris semitransparente de camundongos BALB/c pode ser flatmounted para immunohistologic detalhada análise com coloração de fundo mínimo de não-específica. Neste modelo, angiogênese é impulsionado principalmente pela inflamatória e plasminogênio Ativando sistemas. O modelo induzida por punção é o primeiro para induzir a neovascularização da íris em pequenos roedores e tem a vantagem de permitir a análise directa não invasivo na vivo do processo angiogênico. Além disso, o modelo pode ser combinado com substâncias modulando angiogênico, que destaca seu potencial no estudo da angiogênese com uma perspectiva na vivo .

Filhotes de rato Albino BALB/c em p 12.5 foram submetidas a punções da Úvea, repetidas cada quarto dia (experimental dia 0, 4, 8, 12), até P24.5. Em P27.5, os ratos foram sacrificados e íris cuidadosamente dissecado (experimental dia 15). Fotos de olhos de rato foram tiradas com uma câmera acoplada a um estereoscópio cirúrgico antes de cada série de punção em cada dia experimental para avaliar a avaliação não invasiva da resposta vascular íris. Punções da Úvea induzem uma resposta vascular da íris, provocando a ferida que cura o sistema (Figura 1). Devido a transparência da córnea e camundongos BALB/c de melanina deficiente, aumento de íris vasculatura é facilmente visível de dia experimental 4 (P16.5) e se intensifica durante toda a duração do protocolo. Imagens de imuno-histoquímica para PECAM-1 denotam um aumento na vascularização geral na íris dos olhos perfurados em comparação aos controles (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57398/57398fig1.jpg"> Figura 1: monitorização não invasiva da angiogênese induzida por punção íris. Imagens representativas do dia 0, 4, 8, 12 e 15 do controle e olhos perfurados. Resposta vascular Iris é evidente a partir do 4º dia em diante nos olhos perfurados. Barra de escala = 1 mm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57398/57398fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57398/57398fig2.jpg"> Figura 2: resposta vascular de Iris nos olhos induzida por punção. Imagens ilustrativas de PECAM-1 coloração da 15 íris dia, exibido como visão completa e ampliada área (quadrada), de controle e furou os olhos. Barra de escala = 400 µm (topo); 200 µm (parte inferior). Observe o aumento das ramificações vasculares na íris perfuradas. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57398/57398fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

Neovascularização da íris, uma complicação comum da doença isquêmica da retina, pode levar a risco de vista neovascular glaucoma. Aqui, descrevemos um protocolo murino para induzir a neovascularização da íris experimental que pode ser utilizada para avaliação não invasiva da angiogênese-modulando as substâncias.

Induzida por punção neovascularização de Iris como um modelo do rato da Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

puncture-induced-iris-neovascularization-as-mouse-model-rubeosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.7K visualizações.  Karolinska Institutet. Neovascularização da íris, uma complicação comum da doença isquêmica da retina, pode levar a risco de vista neovascular glaucoma. Aqui, descrevemos um protocolo murino para induzir a neovascularização da íris experimental que pode ser utilizada para avaliação não invasiva da angiogênese-modulando as substâncias.

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Um modelo do rato de No Utero Transplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Medicina

Mouse Complete Stasis Model of Inferior Vena Cava Thrombosis

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE). In the United States (U.S.), the high morbidity and mortality rates make VTE a serious health concern 1-2. After heart disease and stroke, VTE is the third most common vascular disease 3. In the U.S. alone, there is an estimated 900,000 people affected each year, with 300,000 deaths occurring annually 3. A reliable in vivo animal model to study the mechanisms of this disease is necessary.
The advantages of using the mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis are several. The mouse model allows for the administration of very small volumes of limited availability test agents, reducing costs dramatically. Most promising is the potential for mice with gene knockouts that allow specific inflammatory and coagulation factor functions to be delineated. Current molecular assays allow for the quantitation of vein wall, thrombus, whole blood, and plasma for assays. However, a major concern involving this model is the operative size constraints and the friability of the vessels. Also, due to the small IVC sample weight (mean 0.005 grams) it is necessary to increase animal numbers for accurate statistical analysis for tissue, thrombus, and blood assays such as real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), western blot, enzyme-linked immunosorbent (ELISA), zymography, vein wall and thrombus cellular analysis, and whole blood and plasma assays 4-8.
The major disadvantage with the stasis model is that the lack of blood flow inhibits the maximal effect of administered systemic therapeutic agents on the thrombus and vein wall.

The mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis yields quantifiable amounts of vein wall tissue and thrombus. It has proven useful for evaluating interactions between the vein wall and the occlusive thrombus and in assessing the progression from acute to chronic inflammation.

Modelo do mouse completa de Stasis Inferior Trombose da veia cava

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE).  In the United States (U.S.), the high morbidity and ...

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the low-molecular-weight-heparin (LMWH), enoxaparin. There are also urgent clinical situations where it would be important if this could be determined rapidly. The present assay is designed to accomplish this. We only assayed human blood samples that were spiked with known concentrations of enoxaparin. The essential feature of the present assay is the quantification of the efficacy of enoxaparin in a patient's blood sample by degrading it to complete inactivity with heparinase. Two blood samples were drawn into Vacutainer tubes (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) that were spiked with enoxaparin; one sample was digested with heparinase for 5 min at 37 &deg;C, the other sample represented the patient's baseline anticoagulated status. The percent shortening of clotting time in the heparinase-treated sample, as compared to the baseline state, yielded the anticoagulant contribution of enoxaparin. We used the portable, battery operated Hemochron 801 apparatus for measurements of clotting times (International Technidyne Corp., Edison, NJ). The apparatus has 2 thermostatically controlled (37 &deg;C) assay tube wells. We conducted the assays in two types of assay cartridges that are available from the manufacturer of the instrument. One cartridge was modified to increase its sensitivity. We removed the kaolin from the FTK-ACT cartridge by extensive rinsing with distilled water, leaving only the glass surface of the tube, and perhaps the detection magnet, as activators. We called this our minimally activated assay (MAA). The use of a minimally activated assay has been studied by us and others. 2-4 The second cartridge that was studied was an activated partial thromboplastin time (aPTT) assay (A104). This was used as supplied from the manufacturer. The thermostated wells of the instrument were used for both the heparinase digestion and coagulation assays. The assay can be completed within 10 min. The MAA assay showed robust changes in clotting time after heparinase digestion of enoxaparin over a typical clinical concentration range. At 0.2 anti-Xa I.U. of enoxaparin per ml of blood sample, heparinase digestion caused an average decrease of 9.8% (20.4 sec) in clotting time; at 1.0 I.U. per ml of enoxaparin there was a 41.4% decrease (148.8 sec). This report only presents the experimental application of the assay; its value in a clinical setting must still be established.

Demonstration of a rapid quantitative assay of the inhibition of blood coagulation by the low-molecular-weight-heparin, enoxaparin. The contribution of enoxaparin is assessed by removing its influence through digestion with heparinase. A fuller description of the assay is detailed in our published paper.1 The assay still requires clinical confirmation.

Ensaio de Point-of-Care rápida de eficácia anticoagulante enoxaparina em sangue total

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as pre-clinical models to test interventions. In these methods, we describe a technique in which lipopolysaccharide (LPS) is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple, effectively modeling mastitis, or inflammation, of the gland. This simulated infection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, as visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse1.
Our ultimate goal in developing these methods was to study the inflammation associated with mastitis in the lactating gland, which often includes redness, swelling, and immune cell infiltration2,3. Therefore, we were keenly aware that incision or any type of wounding of the skin, the nipple, or the gland in order to introduce the LPS could not be utilized in our methods since the approach would likely confound the read-out of inflammation. We also desired a straight-forward method that did not require specially made hand-drawn pipettes or the use of micromanipulators to hold these specialized tools in place. Thus, we determined to use a commercially available insulin syringe and to inject the agent into the mammary duct of an intact nipple. This method was successful and allowed us to study the inflammation associated with LPS injection without any additional effects overlaid by the process of injection. In addition, this method also utilized an NF-&kappa;B luciferase reporter transgenic mouse and bioluminescent imaging technology to visually and quantitatively show increased NF-&kappa;B signaling within the LPS-injected gland4.
These methods are of interest to researchers of many disciplines who wish to model disease within the lactating mammary gland, as ultimately, the technique described here could be utilized for injection of a number of substances, and is not limited to only LPS.

Described here is a technique in which lipopolysaccharide is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple to simulate mastitis, a condition commonly caused by bacterial infection. Lipopolysaccharide injection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse.

Injeção intraductal de LPS como um modelo do rato de Mastite: Sinalização visualizada através de uma NF-kB Reporter transgênico

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

O<em&gt; Em ovo</em&gt; CAM-ensaio como um Xenograftmodel para o Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Um ferimento Modelo Alkali queima de córnea neovascularização no Rato

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotóxico Estimulação do Microslices cérebro como um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Tachycardia-Induced Cardiomyopathy As a Chronic Heart Failure Model in Swine

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment methods. Here, we present such a model by tachycardia-induced cardiomyopathy, which can be produced by rapid cardiac pacing in swine.
A single pacing lead is introduced transvenously into fully anaesthetized healthy swine, to the apex of the right ventricle, and fixated. Its other end is then tunneled dorsally to the paravertebral region. There, it is connected to an in-house modified heart pacemaker unit that is then implanted in a subcutaneous pocket. 
After 4 - 8 weeks of rapid ventricular pacing at rates of 200 - 240 beats/min, physical examination revealed signs of severe heart failure - tachypnea, spontaneous sinus tachycardia, and fatigue. Echocardiography and X-ray showed dilation of all heart chambers, effusions, and severe systolic dysfunction. These findings correspond well to decompensated dilated cardiomyopathy and are also preserved after the cessation of pacing.
This model of tachycardia-induced cardiomyopathy can be used for studying the pathophysiology of progressive chronic heart failure, especially hemodynamic changes caused by new treatment modalities like mechanical circulatory supports. This methodology is easy to perform and the results are robust and reproducible.

Here, we present a protocol to produce tachycardia-induced cardiomyopathy in swine. This model represents a potent way to study the hemodynamics of progressive chronic heart failure and the effects of applied treatment.

Cardiomiopatia induzida por taquicardia como um modelo de insuficiência cardíaca crônica em suínos

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...