Les auteurs remercient Linnea Tankred et Diana Rydholm pour l’élevage.

Chiots de souris BALB/c des deux sexes ont été utilisés conformément à la déclaration sur l’utilisation des animaux en ophtalmologie et en recherche de Vision, et les protocoles ont été approuvées par le Comité de Stockholm pour la recherche éthique animale. Souris ont été logés dans les litières, ainsi que de la mère qui allaite, avec un cycle jour/nuit de 12 h, le libre accès à la nourriture et l’eau et surveillées quotidiennement.
Remarque : Pour l’intervention chirurgicale, les souris étaient gardés sous anesthésie à l’isoflurane volatil. Pommades oculaires sont déconseillées pendant les procédures d’oculaires, car ils risquent d’interférer avec les traitements et les substances utilisées. Si nécessaire, pour éviter l’oeil sec, une goutte de sérum physiologique stérile normale peut être appliquée. Si crevaisons uvées sont d’auto-guérison, a pris soin au cours de l’uvée crevaisons pour assurer la stérilité avec des instruments chirurgicaux. Traitement post-opératoire inclus hydratation avec une solution saline normale par voie sous-cutanée et avec une administration topique oculaire de chlorhydrate de tétracaïne une analgésie. Les chiots ont été autorisés à récupérer à décubitus sternal sur un coussin chauffant avant d’être retourné à la mère qui allaite, dans une cage propre. Portées ont été conservées avec la mère qui allaite même d’éviter le stress.
1. anesthésie
<ol><li>Préparer la chambre d’induction de l’anesthésie, à administrer l’anesthésie isoflurane et veiller à ce qu’un masque de petite souris est également couplé. Remarque : Effectuez l’expérimentation animale tout en accord avec toutes les autorisations éthiques applicables.</li>
	<li>Pré-remplir la chambre induction avec 3-4 % isoflurane volatils dans l’air atmosphérique. NOTE : Différentes substances anesthésiques autres qu’isoflurane peuvent servir, selon permis éthiques. Des procédures anesthésiques volatils devraient se trouver à bord une hotte ventilée de banc ou de la fumée.</li>
	<li>Placer un chiot souris BALB/c de postnatal (P) âgés de 12,5 jours dans la chambre de l’induction. Confirmer que l’appareil d’anesthésie est prêt à livrer l’isoflurane devant la chambre de l’induction. Remarque : Les souriceaux est fragiles et mieux géré par la peau du cou. Garder les chiots ensemble comme une litière ou avec la mère qui allaite à éviter le stress.</li>
	<li>Laisser le chiot à être complètement anesthésiés.</li>
	<li>Aspirer doucement, le chiot de souris par la peau du cou. NOTE : Gardez la chambre induction fermée en tout temps pour l’induction sûre et stable.</li>
	<li>Transférer la souris dans le masque de rongeur. Assurez-vous de passer le flux d’anesthésique de la chambre de l’induction au masque en déplaçant la souris.</li>
	<li>Effectuer un pincement de l’orteil pour confirmer l’anesthésie.</li>
</ol>2. perforer la procédure sous stéréoscope chirurgicale
<ol><li>Positionnez la souris en position de décubitus latéral. Confirmer que le masque est bien placé donc l’oeil de la souris est dans le champ de vision du stéréoscope.</li>
	<li>Tourner doucement la tête de la souris alors que l’oeil soit vers le haut vers le stéréoscope. NOTE : Claire mise au point de le œil doit être réalisée sous le stéréoscope. Pour le positionnement, un grossissement de 16 X est recommandé, alors que 40 X devrait être utilisé pour effectuer l’intervention chirurgicale. Si permis éthiques permettent, tailler la pointe de la moustache peut faciliter la visualisation de le œil.</li>
	<li>À l’aide de petites pinces égalisateur, saillie soigneusement oeil le chiot en appliquant une pression à la baisse sur les paupières, dorsales et ventrales à le œil.</li>
	<li>Gardez une main douce mais ferme sur paupière du pup, avec une petite pince. Remarque : Il est recommandé d’effectuer la protrusion oculaire et couvercle en tenant avec la main non dominante, comme la main dominante doit exécuter la procédure de ponction.</li>
	<li>Utilisez le stéréoscope pour localiser le limbe cornéen. Limbus BALB/c albinos peuvent être facilement identifiés par le plexus vasculaire circulaire postérieur de la cornée.</li>
	<li>Avec une aiguille biseautée de 0,25 mm de diamètre (30 G), effectuer une petite perforation uvée, près de la limite limbique postérieure de l’uvée. Utiliser seulement la pointe de l’aiguille, et non plus de la moitié le biseau (équivalent à 0,5 mm), percer l’uvée. Si exécutée correctement, les piqûres uvées sont étanches, mais injection intraoculaire d’étude substances peut être administrée par la même blessure de ponction. Remarque : Si éprouvé avec anatomie oculaire de souris, la ponction uvée est exécutée entre le corps ciliaire et l’ora serrata. Il faut tout en effectuant la ponction uvée pour éviter une rupture de la lentille.</li>
	<li>Effectuer la deuxième ponction uvée dans le site en face de l’oeil depuis le premier site de ponction. Optimiser la distance et la position de la perforation ; Pensez à 12 et 06:00 crevaisons, avec 12:00 étant aussi dorsale que possible.</li>
	<li>Répéter l’uvée perforations tous les quatre jours jusqu'à P24.5. Avant chaque ponction uvée successifs, surveiller État animal accordant une attention particulière à la présence d’une cataracte traumatique en raison des dommages de lentille pendant la ponction uvée, soit évidente pression oculaire réduite. But pour l’exécution des ponctions répétées sur les mêmes postes que les perforations antérieures pour un effet optimal.</li>
</ol>3. non invasif in Vivo de surveillance
<ol><li>Avant la ponction ou injections chaque jour expérimentale, anesthésier la souris interprété ci-dessus.</li>
	<li>Avec la souris en position de décubitus latéral, légèrement dépasser le œil.</li>
	<li>Se concentrer sur la vascularisation de l’iris avec le stéréoscope chirurgical.</li>
	<li>Prendre une photo de la vascularisation de l’iris avec un appareil photo monté sur le stéréoscope chirurgical. Remarque : Bien que non nécessaire, induisant la méiose peut être utile pour normaliser la surface de l’iris / animal. Envisager d’éthiques permis lorsque vous sélectionnez un agent inducteur de la méiose. Soigneusement mise au point du système vasculaire iris facilitera davantage l’analyse quantitative. Une grandeur de 40 X est recommandée.</li>
</ol>4. soins postopératoires
<ol><li>Retirer le chiot BALB/c le masque de rongeur et transférer délicatement sur un coussin chauffant en couches avec un treillis chirurgical.</li>
	<li>Appliquer une goutte de solution à 1 % tétracaïne aux yeux crevés. Remarque : Autres solutions analgésiques peuvent être utilisées, selon permis éthiques.</li>
	<li>Hydrater l’animal avec une injection sous-cutanée de 200 µL de solution saline normale stérile.</li>
	<li>Retourner le chiot à la mère qui allaite dans une cage propre souris.</li>
	<li>Surveiller le processus de récupération. Le chiot doit être capable de deambulate et de revenir à la litière.</li>
</ol>5. œil énucléation
<ol><li>Euthanasier l’animal par dislocation cervicale. Effectuer une énucléation et la dissection sous un stéréoscope pour meilleure visualisation de la procédure. Remarque : Les procédures différentes d’euthanasie peuvent être utilisés. Il est recommandé de se conformer strictement aux permis d’éthiques.</li>
	<li>Séparez les paupières pour améliorer l’exposition à le œil.</li>
	<li>Faire une petite incision (environ 0,5 cm) près le canthus des paupières avec des ciseaux courbes de œil Bonn.</li>
	<li>Utilisez l’espace périoculaire exposées pour insérer les micro forceps liant derrière (sous) le monde dans l’orbite.</li>
	<li>Prenez le tissu qui entoure le œil et tirez doucement vers le haut. Éviter d’accrocher le globe oculaire, utiliser les tissus environnants plus près de l’orbite.</li>
	<li>Insérer les ciseaux d’oeil Bonn courbes derrière le globe oculaire dans l’orbite.</li>
	<li>Couper à travers les tissus environnants jusqu’au relâchement de la prise de le œil. NOTE : Cette technique de dissection maintient l’anatomie de le œil et bénéficie d’une analyse ultérieure.</li>
	<li>Procéder à l’ablation du tissu extrinsèque de le œil. Le prélèvement de tissus étrangers peut être effectué après avoir résolu, si l'on préfère. Remarque : Souris BALB/c sont la mélanine déficiente, par conséquent, pour augmenter le contraste, un fond sombre est recommandé pour faciliter la procédure de la dissection.</li>
	<li>Brièvement rincer le œil-ensemble dans une boîte de Pétri remplie de stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Transférer le œil dans un tube de 2 mL contenant 1,5 mL de solution de formaline tamponnée de 4 %.</li>
	<li>Fixez l’oeil pendant 6 h à température ambiante. NOTE : Fixation confère la rigidité du tissu et facilite la dissection de l’iris. Temps de fixation doit être testé et réglé pour différentes applications.</li>
</ol>6. Iris Dissection procédure sous stéréoscope
<ol><li>Enlever la solution de fixation du tube avec une pipette Pasteur en plastique de 1,5 mL (ou similaire) et bien rincer l’oeil trois fois avec du PBS frais.</li>
	<li>Placer le œil fixe dans une surface lisse et sèche (stand de dissection) avec la chambre antérieure vers le haut.</li>
	<li>Avec une aiguille de 30 G biseauté, effectuer un point d’entrée le limbus postérieur.</li>
	<li>Maintenant le segment antérieur d’égalisateur de petites pinces, insérer une astuce de Vannas Clayman ciseaux droites dans l’ouverture créée précédemment. Remarque : Il est recommandé de contrôler la pince avec la main non dominante et le ciseaux avec la dominante.</li>
	<li>Pendant la rotation de le œil avec la pince à lier, couper autour du limbe pour supprimer le segment postérieur de l’oeil. NOTE : Des coupes partielles permettra l’extrémité intérieure de la paire de ciseaux pour continuer dans les tissus et grandement facilite le processus.</li>
	<li>Positionner le segment antérieur vers le bas, exposant la lentille.</li>
	<li>Retirez soigneusement la lentille il saisissant avec une petite pince et tirez vers le haut. Remarque : Une aiguille biseautée peut être utilisée pour perforer et tirez la lentille.</li>
	<li>Positionner le segment antérieur avec la cornée vers le bas et la coupe perpendiculaire au champ de vision.</li>
	<li>Saisir délicatement le tissu postérieur au corps ciliaire avec les petites pinces égalisateur.</li>
	<li>Avec des ciseaux droites Vannas Clayman, procéder pour couper juste en avant du corps ciliaire pour enlever le réseau trabéculaire et isoler l’iris. Confirmer que le réseau trabéculaire est supprimé ; l’iris doit se déplacer au sein de la cornée.</li>
	<li>Transvaser avec soin le œilleton antérieur avec les petites pinces égalisateur, tenant de la cornée, d’une plaque à 96 puits contenant 200 µL de PBS.</li>
	<li>Continuez à tenir la cornée dans le puits et disséquer l’iris en la rinçant avec du PBS avec une pipette. Remarque : Si l’iris reste fidèle à la cornée, certains trabéculaire peut être présent et le biseau d’une aiguille 30 G peut servir à aider à déplacer l’iris.</li>
	<li>Retirez le 96 puits avec les petites pinces liant la cornée et garder l’iris isolé dans le puits pour une analyse plus approfondie.</li>
	<li>Conserver les échantillons d’iris flottant à 4 ° C. Remarque : Malgré étant fixée, stockage à long terme des échantillons flottant d’iris n’est pas recommandé.</li>
</ol>7. possibles afficheurs expérimentales
<ol><li>Afin de visualiser les vaisseaux sanguins dans l’iris disséqués, utilisez flottant entier-Montez immunohistochemistry souillant des méthodes pour marqueurs tels que la molécule d’adhérence des cellules endothéliales plaquettaire (PECAM) -1 ou isolectine B4. Également utiliser la perfusion de tout le corps avec une coloration vasculaire, comme les dextranes fluorescent-étiquetées de haut poids moléculaire.</li>
	<li>In vivo des images non invasive permet d’effectuer en silico plat-montage et quantifier la vascularisation iris complet avec un logiciel d’imagerie approprié. Remarque : Le système vasculaire peut être quantifié, aussi bien in vivo et in vitro, à l’aide de densitométrie ou avec le système vasculaire du logiciel analyse9.</li>
	<li>Traiter le œil entier pour les acides nucléiques et extraction de la protéine, suivie par les méthodes PCR ou immunoblotting, pour effectuer l’analyse moléculaire des yeux crevés. NOTE : L’analyse moléculaire des tissus est préférable d’effectuer avec les tissus non fixée, mais dissection des iris non fixée est extrêmement difficile, et l’utilisation de l’oeil entier a rendu des résultats statistiquement significatifs dans les précédentes études8.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Morrison, J. C., Van Buskirk, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+collateral+circulation+in+the+primate+eye.">Anterior collateral circulation in the primate eye.</a> Ophthalmology. 90 (6), 707-715 (1983).</li><li>Dreyfuss, J. L., Giordano, R. J., Regatieri, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Angiogenesis.">Ocular Angiogenesis.</a> J Ophthalmol. 2015, 892043 (2015).</li><li>Breuss, J. M., Uhrin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-initiated+angiogenesis+and+the+uPA/uPAR+system.">VEGF-initiated angiogenesis and the uPA/uPAR system.</a> Cell Adh Migr. 6 (6), 535-615 (2012).</li><li>Rodrigues, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neovascular+glaucoma:+a+review.">Neovascular glaucoma: a review.</a> Int J Retina Vitreous. 2, 26 (2016).</li><li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+retina+as+an+angiogenesis+model.">The mouse retina as an angiogenesis model.</a> Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).</li><li>DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+wound+repair:+when+enough+is+enough.">Angiogenesis and wound repair: when enough is enough.</a> J Leukocy Biol. 100 (5), 979-984 (2016).</li><li>Eming, S., Brachvogel, B., Odorisio, T., Koch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+angiogenesis:+Wound+healing+as+a+model.">Regulation of angiogenesis: Wound healing as a model.</a> Prog Histochem Cytoc. 42 (3), 115-170 (2007).</li><li>Beaujean, O., Locri, F., Aronsson, M., Kvanta, A., Andr&#233;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+model+of+puncture-induced+iris+neovascularization.">A novel in vivo model of puncture-induced iris neovascularization.</a> PloS One. 12 (6), e0180235 (2017).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Computational+Tool+for+Quantitative+Analysis+of+Vascular+Networks.">A Computational Tool for Quantitative Analysis of Vascular Networks.</a> PloS One. 6 (11), (2011).</li><li>Dorrell, M., Uusitalo-Jarvinen, H., Aguilar, E., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+neovascularization:+basic+mechanisms+and+therapeutic+advances.">Ocular neovascularization: basic mechanisms and therapeutic advances.</a> Surv Ophthalmol. 52 Suppl 1, S3-S19 (2007).</li><li>Kvanta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+angiogenesis:+the+role+of+growth+factors.">Ocular angiogenesis: the role of growth factors.</a> Acta Ophthalmol. 84 (3), 282-288 (2006).</li><li>Salman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrasilicone+Bevacizumab+Injection+for+Iris+Neovascularization+after+Vitrectomy+for+Proliferative+Diabetic+Retinopathy.">Intrasilicone Bevacizumab Injection for Iris Neovascularization after Vitrectomy for Proliferative Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmic Res. 49 (1), 20-24 (2013).</li><li>Jeong, Y. C., Hwang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etiology+and+Features+of+Eyes+with+Rubeosis+Iridis+among+Korean+Patients:+A+Population-Based+Single+Center+Study.">Etiology and Features of Eyes with Rubeosis Iridis among Korean Patients: A Population-Based Single Center Study.</a> PloS One. 11 (8), e0160662 (2016).</li><li>Speier, S., Nyqvist, D., K&#246;hler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. -. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nat Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Stefansson, E., Landers, M. B., Wolbarsht, M. L., Klintworth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neovascularization+of+the+Iris+-+an+Experimental-Model+in+Cats.">Neovascularization of the Iris - an Experimental-Model in Cats.</a> Invest Ophth Vis Sci. 25 (3), 361-364 (1984).</li><li>Nork, T. M., Tso, M., Duvall, J., Hayreh, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Mechanisms+of+Iris+Neovascularization+Secondary+to+Retinal+Vein+Occlusion.">Cellular Mechanisms of Iris Neovascularization Secondary to Retinal Vein Occlusion.</a> Arch Ophthalmol-Chic. 107 (4), 581-586 (1989).</li><li>Hjelmeland, L. M., Stewart, M. W., Li, J. W., Toth, C. A., Burns, M. S., Landers, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Experimental-Model+of+Ectropion+Uveae+and+Iris+Neovascularization+in+the+Cat.">An Experimental-Model of Ectropion Uveae and Iris Neovascularization in the Cat.</a> Invest Ophth Vis Sci. 33 (5), 1796-1803 (1992).</li><li>Tolentino, M. J., Miller, J. W., Gragoudas, E. S., Chatzistefanou, K., Ferrara, N., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+is+sufficient+to+produce+iris+neovascularization+and+neovascular+glaucoma+in+a+nonhuman+primate.">Vascular endothelial growth factor is sufficient to produce iris neovascularization and neovascular glaucoma in a nonhuman primate.</a> Arch Ophthalmol-Chic. 114 (8), 964-970 (1996).</li><li>Paula, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+Rubeosis+Iridis+Induced+by+Intravitreal+Latex-derived+Angiogenic+Fraction.">Rabbit Rubeosis Iridis Induced by Intravitreal Latex-derived Angiogenic Fraction.</a> Curr Eye Res. 36 (9), 857-859 (2011).</li><li>Takei, A., Ekstr&#246;m, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Transfer+of+Prolyl+Hydroxylase+Domain+2+Inhibits+Hypoxia-inducible+Angiogenesis+in+a+Model+of+Choroidal+Neovascularization.">Gene Transfer of Prolyl Hydroxylase Domain 2 Inhibits Hypoxia-inducible Angiogenesis in a Model of Choroidal Neovascularization.</a> Sci Rep. 7, 42546 (2017).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans le présent protocole, une nouvelle méthode pour l’induction de la réponse vasculaire iris par ponction uvée est présentée. La piqûre déclenche les mécanismes de guérison de blessure et favorise des réponses vasculaires dans l’iris10,11. C’est en accord avec les pathologies oculaires, tels que le PDR et les lunettes de vision nocturne, où réponses angiogénique exacerbée de la rétine dans le segment postérieur de le œil son point culminant dans l’état clinique de rubeosis iridis, une vascularisation accrue de l’iris12 ,,13.
La cornée est avasculaire et possède une structure particulière de collagène résultant en transparence. Dans cette optique, l’angiographie du segment antérieur de le œil pour la visualisation du système vasculaire iris est réalisable par visualisation directe des vaisseaux sanguins iris avec in vivo des méthodes non invasives13,14. Modèles précédents de la néovascularisation iris s’est appuyé sur des animaux aux grands yeux où des interventions chirurgicales complexes ont été effectué15,16,17, ou par l’injection intraoculaire de substances spécifiques angiogénique 18 , 19. dans cette méthode, l’utilisation de souris BALB/c carencées en pigment permet l’observation directe de l’iris vascularisation in vivoet permet une quantification non invasive de la néovascularisation iris chez la souris, fournissant ainsi un nouvel outil pour étudier la in vivo l’angiogenèse.
En outre, la méthode présentée pour une dissection souris iris permet l’analyse de la néovascularisation iris induite par la ponction avec des marqueurs spécifiques vasculaires. Ici, iris navires ont été exemple colorées avec les anticorps PECAM-1 et visualisées par microscopie à fluorescence. Immunomarquage flottant, entier-montent des protocoles sont facilement obtenus et assez régulières. En outre, les méthodes de perfusion pour les vaisseaux sanguins peuvent être effectuées dans ce modèle. Coloration spécifique vasculaire accorde évaluation de la structure des vaisseaux sanguins d’iris et donc la quantification, par axée sur l’utilisateur ou des logiciels d’analyse, de l’iris neovasculature9. Comme décrit précédemment8,20, l’illustration du neovasculature de l’iris a été évaluée au jour 15 après-puncture-induction. Néanmoins, les effets sur la vascularisation de l’iris peuvent être observées dès le jour 4 post-puncture-induction, ce qui suggère qu’évaluation du modèle iris induite par ponction néovascularisation pourrait effectuer à différents moments, basés sur la propre conditions expérimentales.
Il convient de préciser que ce protocole présente certaines difficultés, notamment liées à la taille d’un yeux de souris par rapport à d’autres modèles animaux. Doit être très prudent lors de l’exécution de la procédure de ponction uvée, pour éviter les touches de la lentille ou d’endommager le œil. Observation de l’État oculaire est paramount et les animaux présentant des cataractes liées à expérimental ou chute de pression oculaire devrait être exclus et euthanasié de manière appropriée. Iris de souris sont extrêmement fragiles et un peu collante. Bonne dissection et l’isolement du tissu présente une autre étape cruciale pour le protocole. Une bonne séparation d'avec le trabéculum est nécessaire pour le déplacement de l’iris de la chambre antérieure. En outre, en raison de la fragilité, l’isolement iris nécessite la fixation du tissu, qui altère l’analyse moléculaire en aval. Cependant, une analyse moléculaire d’interprétation ensemble-œil a été appliquée avec succès à la méthode présentée8.
En résumé, le protocole décrit présente un modèle de souris de néovascularisation de nouveaux iris induite par la ponction. Ce modèle a l’avantage de permettre en vivo non invasive visualisation directe de l’angiogenèse. En outre, l’utilisation de petits rongeurs rend le modèle présenté attrayant pour les études de rubeosis iridis, car il évite l’utilisation d’animaux aux grands yeux et accompagné de restriction éthique. En outre, la procédure peut être associée à l’injection de substances pro - ou anti-angiogéniques par la ponction auto-obturant, améliorer son utilité comme un nouveau modèle de in vivo de l’angiogenèse.

L’iris, ainsi que le corps ciliaire et la choroïde, compose de l’uvée, qui est un tissu plus vascularisé de le œil. Système vasculaire Iris est essentiel pour maintenir l’homéostasie dans la chambre antérieure de le œil. Par suite de l’abondantes connexions anastomose entre les artères et les veines, vaisseaux sanguins iris fournissent nutriments et alimentation en oxygène non seulement à l’iris elle-même, mais à l’ensemble du segment antérieur de l' oeil1.
La formation de nouveaux vaisseaux, ou angiogenèse de celles existantes, est fondamentale dans les processus physiologiques, tels que le développement et la guérison2. L’angiogenèse est finement régulée par une multitude de facteurs canoniques comme facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et inhibiteur de l’activateur du plasminogène (PAI), ainsi que plusieurs facteurs inflammatoires, et un déséquilibre de ces facteurs peut mener à pathologiques 3de l’angiogenèse.
Dans le œil, une néovascularisation est la cause de maladies mortelles vue, telles que la rétinopathie diabétique proliférante (PDR) et le glaucome néovasculaire (NVG). Dans ces maladies oculaires, la néovascularisation focale est couramment située dans les tissus rétiniens, encore le déséquilibre inflammatoires et de facteurs angiogéniques dans les deux postérieures et antérieures chambres oculaires de le œil a été associée par rubeosis iridis, le terme clinique pour iris néoangiogenèse pathologique4. Ces pathologies indiquent la capacité de l’iris adulte pour subir l’angiogenèse. Chez les souris, système vasculaire oculaire est immature après la naissance et poursuit après l’accouchement de la maturation. Cette particularité du développement est exploitée dans le modèle murin de la rétinopathie induite par l’oxygène, un modèle qui imite étroitement l’état clinique de la rétinopathie de la prématurité5. En outre, l’angiogenèse et l’inflammation jouent un rôle essentiel dans la guérison des mécanismes6, et la guérison elle-même a été associée à l’angiogenèse modèles7.
Dans cette étude, nous décrivons un modèle de la néovascularisation iris induite par la ponction. Uvée crevaisons sont effectués près de la limite extérieure de la limbe, qui induisent une néovascularisation iris en déclenchant la système de cicatrisation. Grâce à la transparence de la cornée, la vascularisation de l’iris peut être analysé facilement in vivo par des méthodes non invasives. Les yeux crevés présentent une augmentation du lit vasculaire dans l’iris, qui a été associée à une augmentation de l’activation du plasminogène et marqueurs inflammatoires8. Le modèle présenté possède un grand potentiel comme un nouvel outil pour étudier l’angiogenèse et criblage de composés angiogénique et permet direct en vivo visualisation des processus angiogénique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn eye scissors</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>23060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman-Vannas curved scissors</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>E3383 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman-Vannas straight scissors</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>E3383 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective adapter for camera</td>
			<td>Handcrafted</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Or any system that allows adapting a camera to the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad 100-110 watts</td>
			<td>Non Applicable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Available in pet/veterinarian stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic 30g beveled needle</td>
			<td>KDM GmBH germany</td>
			<td>911914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iphone 4S</td>
			<td>Apple</td>
			<td>Non Applicable</td>
			<td>Or other high resolution image acquistion device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>KDG 9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson tying forceps</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>E1815 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tying forceps</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims tetracaine hydrochloride</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N/A</td>
			<td>1 % (w/v) Eye Drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral-buffered formalin</td>
			<td>Bioreagens</td>
			<td>0018-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline solution</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>210352</td>
			<td>0.9 % (w/v) NaCl in injectable water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Balanced and buffered PBS pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 10 cm</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 3 cm</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe Seal Tube 2.0 mL</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>72.685.200</td>
			<td>Or any eppendorf style tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC plate 96-well</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 3.5 mL</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td>Or any other Pasteur pipette style</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Univentor 400 anesthesia unit</td>
			<td>Univentor Limited</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild M650 surgical microscope</td>
			<td>Wild Heerbrugg</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Or other surgical or magnifying stereoscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

puncture-induced iris neovascularization as a mouse model of rubeosis iridis

Nous décrivons un modèle de la néovascularisation iris induite par ponction comme un modèle général pour l’évaluation non invasive de l’angiogenèse. Le modèle est également pertinent pour cibler un glaucome néovasculaire, une complication vue en danger de la rétinopathie diabétique. Cette méthode est basée sur l’induction de la réponse vasculaire iris par une série d’auto-obturant uvées crevaisons sur souris BALB/c et profite de la maturation postnatale du système vasculaire oculaire de souris. Souriceaux subissent uvées crevaisons de jour après la naissance 12.5, quand les chiots naturellement ouvrent leurs yeux, jusqu’au jour après la naissance 24,5. Grâce à la transparence de la cornée, la vascularisation iris peut être analysée facilement à travers le temps par des méthodes non invasives en vivo . En outre, l’iris translucide de souris BALB/c peut être flatmounted pour l’analyse détaillée immunohistologiques minime non-spécifiques fond de coloration. Dans ce modèle, angiogenèse est principalement conduit par l’inflammation et le plasminogène activation de systèmes. Le modèle induite par la ponction est le premier à induire la néovascularisation iris chez les petits rongeurs et a l’avantage de permettre de direct non invasif en vivo analyse du processus angiogénique. En outre, le modèle peut être associé angiogénique substances modulant, qui met en évidence son potentiel dans l’étude de l’angiogenèse dans une perspective in vivo .

Albino BALB/c souriceaux à P12.5 ont été soumis aux crevaisons uvées, répétées chaque jour quatrième (experimental jour 0, 4, 8, 12), jusqu’au P24.5. À P27.5, les souris ont été euthanasiés et IRIS soigneusement disséqué (experimental jour 15). Photos des yeux de souris ont été prises avec une caméra attachée à un stéréoscope chirurgical avant chaque série de ponction dans chaque jour expérimentale pour évaluer l’évaluation non invasive de la réponse vasculaire de l’iris. Ponctions uvées induisent une réponse vasculaire de l’iris en déclenchant la cicatrisation du système (Figure 1). En raison de la transparence de la cornée et de la souris BALB/c déficients en mélanine, système vasculaire accrue iris est facilement visible de jour expérimental 4 (P16.5) et s’intensifie pendant toute la durée du protocole. Images d’immunohistochimie pour PECAM-1 indiquent une augmentation globale système vasculaire dans l’iris des yeux crevés par rapport aux témoins (Figure 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57398/57398fig1.jpg"> Figure 1 : surveillance non invasive de l’angiogenèse induite par ponction iris. Images représentatives du jour 0, 4, 8, 12 et 15 de contrôle et les yeux crevés. La réponse vasculaire Iris ressort du jour 4, dans les yeux crevés. Echelle = 1 mm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57398/57398fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57398/57398fig2.jpg"> Figure 2 : réponse vasculaire Iris induite par ponction yeux. Images d’illustration du PECAM-1 coloration de le 15 Iris jour, affiché sous la forme pleine vue et amplifiée zone (carré), de contrôle et crevé les yeux. Echelle = 400 µm (en haut) ; 200 µm (en bas). Note de l’augmentation des branches vasculaires dans IRIS percés. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57398/57398fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

La néovascularisation IRIS, une complication fréquente de la maladie ischémique de la rétine, peut conduire à vue en danger de glaucome néovasculaire. Nous décrivons ici un protocole murin pour induire la néovascularisation iris expérimentaux qui peut-être être utilisée pour l’évaluation non invasive de substances modulant l’angiogenèse.

Induite par la ponction de néovascularisation Iris comme un modèle de souris de Rubeosis Iridis

We describe a model of puncture-induced iris neovascularization as a general model for noninvasive evaluation of angiogenesis. The model is also relevant ...

puncture-induced-iris-neovascularization-as-mouse-model-rubeosis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.7K vues.  Karolinska Institutet. La néovascularisation IRIS, une complication fréquente de la maladie ischémique de la rétine, peut conduire à vue en danger de glaucome néovasculaire. Nous décrivons ici un protocole murin pour induire la néovascularisation iris expérimentaux qui peut-être être utilisée pour l’évaluation non invasive de substances modulant l’angiogenèse.

Vidéo: Puncture-Induced Iris Neovascularization as a Mouse Model of Rubeosis Iridis

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modèle murin de In utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

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Médecine

Mouse Complete Stasis Model of Inferior Vena Cava Thrombosis

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE). In the United States (U.S.), the high morbidity and mortality rates make VTE a serious health concern 1-2. After heart disease and stroke, VTE is the third most common vascular disease 3. In the U.S. alone, there is an estimated 900,000 people affected each year, with 300,000 deaths occurring annually 3. A reliable in vivo animal model to study the mechanisms of this disease is necessary.
The advantages of using the mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis are several. The mouse model allows for the administration of very small volumes of limited availability test agents, reducing costs dramatically. Most promising is the potential for mice with gene knockouts that allow specific inflammatory and coagulation factor functions to be delineated. Current molecular assays allow for the quantitation of vein wall, thrombus, whole blood, and plasma for assays. However, a major concern involving this model is the operative size constraints and the friability of the vessels. Also, due to the small IVC sample weight (mean 0.005 grams) it is necessary to increase animal numbers for accurate statistical analysis for tissue, thrombus, and blood assays such as real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), western blot, enzyme-linked immunosorbent (ELISA), zymography, vein wall and thrombus cellular analysis, and whole blood and plasma assays 4-8.
The major disadvantage with the stasis model is that the lack of blood flow inhibits the maximal effect of administered systemic therapeutic agents on the thrombus and vein wall.

The mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis yields quantifiable amounts of vein wall tissue and thrombus. It has proven useful for evaluating interactions between the vein wall and the occlusive thrombus and in assessing the progression from acute to chronic inflammation.

Modèle de souris complète stase de la veine cave inférieure thrombose

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE).  In the United States (U.S.), the high morbidity and ...

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the low-molecular-weight-heparin (LMWH), enoxaparin. There are also urgent clinical situations where it would be important if this could be determined rapidly. The present assay is designed to accomplish this. We only assayed human blood samples that were spiked with known concentrations of enoxaparin. The essential feature of the present assay is the quantification of the efficacy of enoxaparin in a patient's blood sample by degrading it to complete inactivity with heparinase. Two blood samples were drawn into Vacutainer tubes (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) that were spiked with enoxaparin; one sample was digested with heparinase for 5 min at 37 &deg;C, the other sample represented the patient's baseline anticoagulated status. The percent shortening of clotting time in the heparinase-treated sample, as compared to the baseline state, yielded the anticoagulant contribution of enoxaparin. We used the portable, battery operated Hemochron 801 apparatus for measurements of clotting times (International Technidyne Corp., Edison, NJ). The apparatus has 2 thermostatically controlled (37 &deg;C) assay tube wells. We conducted the assays in two types of assay cartridges that are available from the manufacturer of the instrument. One cartridge was modified to increase its sensitivity. We removed the kaolin from the FTK-ACT cartridge by extensive rinsing with distilled water, leaving only the glass surface of the tube, and perhaps the detection magnet, as activators. We called this our minimally activated assay (MAA). The use of a minimally activated assay has been studied by us and others. 2-4 The second cartridge that was studied was an activated partial thromboplastin time (aPTT) assay (A104). This was used as supplied from the manufacturer. The thermostated wells of the instrument were used for both the heparinase digestion and coagulation assays. The assay can be completed within 10 min. The MAA assay showed robust changes in clotting time after heparinase digestion of enoxaparin over a typical clinical concentration range. At 0.2 anti-Xa I.U. of enoxaparin per ml of blood sample, heparinase digestion caused an average decrease of 9.8% (20.4 sec) in clotting time; at 1.0 I.U. per ml of enoxaparin there was a 41.4% decrease (148.8 sec). This report only presents the experimental application of the assay; its value in a clinical setting must still be established.

Demonstration of a rapid quantitative assay of the inhibition of blood coagulation by the low-molecular-weight-heparin, enoxaparin. The contribution of enoxaparin is assessed by removing its influence through digestion with heparinase. A fuller description of the assay is detailed in our published paper.1 The assay still requires clinical confirmation.

Rapid Point-of-Care Test de l&#39;efficacité anticoagulante énoxaparine dans le sang total

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

Intraductal Injection of LPS as a Mouse Model of Mastitis: Signaling Visualized via an NF-&kappa;B Reporter Transgenic

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as pre-clinical models to test interventions. In these methods, we describe a technique in which lipopolysaccharide (LPS) is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple, effectively modeling mastitis, or inflammation, of the gland. This simulated infection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, as visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse1.
Our ultimate goal in developing these methods was to study the inflammation associated with mastitis in the lactating gland, which often includes redness, swelling, and immune cell infiltration2,3. Therefore, we were keenly aware that incision or any type of wounding of the skin, the nipple, or the gland in order to introduce the LPS could not be utilized in our methods since the approach would likely confound the read-out of inflammation. We also desired a straight-forward method that did not require specially made hand-drawn pipettes or the use of micromanipulators to hold these specialized tools in place. Thus, we determined to use a commercially available insulin syringe and to inject the agent into the mammary duct of an intact nipple. This method was successful and allowed us to study the inflammation associated with LPS injection without any additional effects overlaid by the process of injection. In addition, this method also utilized an NF-&kappa;B luciferase reporter transgenic mouse and bioluminescent imaging technology to visually and quantitatively show increased NF-&kappa;B signaling within the LPS-injected gland4.
These methods are of interest to researchers of many disciplines who wish to model disease within the lactating mammary gland, as ultimately, the technique described here could be utilized for injection of a number of substances, and is not limited to only LPS.

Described here is a technique in which lipopolysaccharide is injected into the lactating mouse mammary gland via the nipple to simulate mastitis, a condition commonly caused by bacterial infection. Lipopolysaccharide injection results in increased nuclear factor kappa B (NF-&kappa;B) signaling, visualized through bioluminescent imaging of an NF-&kappa;B luciferase reporter mouse.

Injection intra-canalaire de LPS comme un modèle de souris de la mammite: signalisation visualisée via un transgénique NF-kB Reporter

Animal models of human disease are necessary in order to rigorously study stages of disease progression and associated mechanisms, and ultimately, as ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Le<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-test comme un Xenograftmodel pour le sarcome

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Un Alkali-brûlures modèle de néovascularisation cornéenne chez la souris

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Excitotoxiques stimulation de Microslices cerveau comme un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de l&#39;AVC

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Un modèle de souris pour induite par laser néovascularisation choroïdienne

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

Tachycardia-Induced Cardiomyopathy As a Chronic Heart Failure Model in Swine

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment methods. Here, we present such a model by tachycardia-induced cardiomyopathy, which can be produced by rapid cardiac pacing in swine.
A single pacing lead is introduced transvenously into fully anaesthetized healthy swine, to the apex of the right ventricle, and fixated. Its other end is then tunneled dorsally to the paravertebral region. There, it is connected to an in-house modified heart pacemaker unit that is then implanted in a subcutaneous pocket. 
After 4 - 8 weeks of rapid ventricular pacing at rates of 200 - 240 beats/min, physical examination revealed signs of severe heart failure - tachypnea, spontaneous sinus tachycardia, and fatigue. Echocardiography and X-ray showed dilation of all heart chambers, effusions, and severe systolic dysfunction. These findings correspond well to decompensated dilated cardiomyopathy and are also preserved after the cessation of pacing.
This model of tachycardia-induced cardiomyopathy can be used for studying the pathophysiology of progressive chronic heart failure, especially hemodynamic changes caused by new treatment modalities like mechanical circulatory supports. This methodology is easy to perform and the results are robust and reproducible.

Here, we present a protocol to produce tachycardia-induced cardiomyopathy in swine. This model represents a potent way to study the hemodynamics of progressive chronic heart failure and the effects of applied treatment.

Cardiomyopathie induite par la tachycardie comme un modèle de l’insuffisance cardiaque chronique chez le porc

A stable and reliable model of chronic heart failure is required for many experiments to understand hemodynamics or to test effects of new treatment ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...