Este trabalho foi financiado pela Agência de promoção de pesquisa austríaco (FFG: Projeto número 850681), a iniciativa da University of Applied Sciences Upper Austria financiamento básico (projeto GlucoSTAR) e o centro de inovação tecnológica na medicina (centro de temporizado) que recebe financiamento básico pela província de Alta Áustria.

De acordo com a Directiva 2010/63/UE, experiências com embriões aviários não-nascidos durante os primeiros dois terços do desenvolvimento embrionário não precisa de permissão por um Comitê de ética.
1. armazenamento e reprodução dos ovos
<ol><li>Obter ovos fertilizados de galinha (Tabela de materiais) de um criador local. Nota: Os ovos podem ser armazenados a 14 ° C, em um ambiente umidificado para até 10 dias após a postura antes da utilização para experimentos.</li>
	<li>Incubar os ovos a 38 ° C com uma umidade média de 40-60% para 10 ou 11 dias em uma incubadora que constantemente transforma os ovos.</li>
</ol>2. selecção dos ovos
<ol><li>Verifique os ovos para fertilização após incubação de até 11 dias. Use uma luz transiluminação para esta etapa. Mergulhe um inkpad a franja da lâmpada transiluminação e vela o lado pontiagudo do ovo.</li>
	<li>Para identificar a bexiga de ar, verifique se há diferenças de brilho na parte superior do ovo. Nota: A bexiga de ar aparece como uma região mais transparente, redonda, enquanto a albumina é mais escura, quando o ovo é transiluminado.</li>
	<li>Após a detecção da bexiga de ar, marca o local pressionando a lâmpada ligeiramente contra o ovo com a tinta aplicada anteriormente.</li>
	<li>Exclua os ovos não-fertilizados neste passo, que não mostram uma diferença de brilho entre a albumina e a bexiga de ar.</li>
</ol>3. a injeção de substâncias
<ol><li>Prepare a substância de interesse (por exemplo, o extrato de ervas ou insulina) diluindo a substância na concentração desejada no buffer de solução salina equilibrada (HBSS) do Hank. Por exemplo, 3.3 U/mL de um análogo em HBSS de insulina comercialmente disponível.</li>
	<li>Para a aplicação do composto selecionado, cuidadosamente bicar a casca de ovo com um aguçado par de pinças na área marcada da bexiga de ar. Não fazem um buraco maior que o diâmetro da agulha da seringa. Injete a solução-tampão (300 µ l) contendo a substância de interesse para a área de perfura através de uma seringa. Nota: Use seringas de uso único estéril de 1 ml, pontas de pipetas e navios. Use luvas e avental para os experimentos.</li>
	<li>Para determinar o efeito de reduzir a glicose do sangue de uma substância, coloque os ovos para a incubadora para 60, 120 e 180 min, respectivamente. Para determinar os níveis basais de glicose, inclua pelo menos 10-15 ovos de controle não tratados.</li>
</ol>4. toxicidade
<ol><li>Após a aplicação do composto selecionado para 24h, equilibrar a membrana da casca de ovo com tampão de fosfato salina tamponada (PBS) (suficiente para cobrir a membrana da casca de ovo inteiro) pelo menos 30 s.</li>
	<li>Remova o excesso tampão PBS por coloca-lo fora.</li>
	<li>Retire a membrana da casca cuidadosamente um aguçado par de pinças.</li>
	<li>Verifique os vasos sanguíneos para lesões e confirme a vitalidade (por exemplo, movimento) do embrião do pintinho. Nota: Consulte a Figura 1 para comparação de vital versus não-vitais embriões após a aplicação de um extrato de ervas tóxica.</li>
</ol>5. medição do valor de glicose no sangue
<ol><li>No ponto respectivo tempo, retire a casca de ovo acima da bexiga de ar cuidadosamente e equilibrar a membrana da casca de ovo com o tampão PBS (suficiente para cobrir a membrana da casca de ovo inteiro).</li>
	<li>Remova o excesso tampão PBS por coloca-lo fora.</li>
	<li>Cuidadosamente retire a membrana da casca com um aguçado par de pinças.</li>
	<li>Corte e retire a membrana corioalantoicas com uma microtesoura, para permitir bom acesso adequado dos vasos sanguíneos. Cortar a membrana pelo menos 2-3 cm. Não corte qualquer grandes vasos na membrana própria para evitar a perda de sangue não desejadas do embrião.</li>
	<li>Localize o grande navio proveniente do abdômen do embrião. Levante este navio fora a albumina com uma microtesoura fechada e coloque-o em uma pH-tira de plástico. Mover a faixa de pH sob o vaso, que é realizado com o microtesoura, e puxar para trás a microtesoura fora cuidadosamente.</li>
	<li>Retire 1 a 2 mL do líquido sob a membrana corioalantoicas com uma pipeta para evitar a diluição do sangue na próxima etapa. Seca o vaso e tira de pH com papel de filtro, antes do navio é cortado.</li>
	<li>Corte o vaso sanguíneo cuidadosamente com uma tesoura microde um lado. Não corte o navio completamente. Nota: O navio é aproximadamente 1 mm de espessura. Não corte mais da metade do navio para evitar cortar através do navio inteiramente, como ele pode escorregar na Strip e não coleta de sangue é possível.</li>
	<li>Colete o sangue vazando na faixa de pH usando uma pipeta. 10 microlitros de sangue são necessários para determinar os níveis de glicose, usando o medidor de glicose no sangue.</li>
</ol>6. estatística avaliação
<ol><li>Calcular o valor médio de pelo menos 10 ovos individuais por ponto do tempo e normalizar esses valores para o controle ovos (ovos não ou tampão-tratados).</li>
	<li>Posteriormente, determine a percentagem de redução. Além disso, uso de insulina como um controle positivo. Nota: Repita cada experiência pelo menos três vezes.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet:+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus.">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li><li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li><li>Han Cho, N., Cavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDF Diabetes Atlas. 7, (2015).</li><li>Bailey, C. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+medication+initiation+in+newly+diagnosed+diabetes+mellitus:+quality+and+cost+implications.">Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications.</a> The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).</li><li>Martel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-obesogenic+and+antidiabetic+effects+of+plants+and+mushrooms.">Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms.</a> Nature reviews. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new+methodological+aspects+of+the+hen's+egg+test+for+micronucleus+induction+(HET-MN).">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O ensaio de HET-CAM é um sistema amplamente utilizado testes alternativos à experimentação animal no setor12. O sistema no ovo descrito aqui representa uma versão modificada do ensaio HET-CAM. Enquanto em sua forma original, são realizados experimentos de HET-CAM para estudar as propriedades irritantes de compostos e formulação ou a análise da angiogênese14,15,16, adaptámos a abordagem para testar compostos com características insulino-mimética putativo12. De acordo com a Directiva 2010/63/UE, experiências com embriões aviários não-nascidos durante os primeiros dois terços do desenvolvimento embrionário não precisa de permissão por um Comité de ética desde que estas experiências não são consideradas as experiências com animais. Estudos recentes demonstraram a adequação do sistema no ovo para caracterizar a eficácia de extratos de ervas selecionadas, que foram identificados em uma tela principal GLUT4 translocação-com base em10, para reduzir os níveis de glicose do sangue na ausência de insulina12,13. Pontos críticos para um bom desempenho do sistema no ovo incluem: primeiro, um criador de confiança entregar os ovos fertilizados. A galinha marrom clássica de Lohmann é uma boa escolha da raça. Em segundo lugar, a implementação de toxicidade testes para excluir os efeitos tóxicos do composto investigado precisa ser feito. Além disso, a preparação de um vaso sanguíneo adequado para coleta de sangue é importante. É importante evitar o corte de grandes vasos na membrana corioalantoicas em si, como isso pode levar a uma não-preferível perda de sangue. Além disso, antes do navio é cortado na faixa de pH, tem que ser revistado seco usando papel de filtro para evitar a diluição do sangue coletado. Finalmente, um número suficiente de experiências parece ser importante. Nós recomendamos usar pelo menos 10 ovos para cada ponto de tempo e uma tríplice repetição do experimento respectivo.
Naturalmente, há algumas limitações desta abordagem no ovo . Uma vez que leva até 30 minutos até que as substâncias são absorvidas através da membrana da casca e entraram em contato com a membrana corioalantoicas, não é possível quantificar uma resposta rápida do embrião para o composto aplicado. Além disso, alguns compostos podem ser tóxicos na concentração aplicada, que frequentemente resulta em lesões dos vasos sanguíneos na membrana corioalantoicas. Assim, testes de citotoxicidade baseado em incubação a longo prazo dos compostos por cerca de 24 horas parece razoável. Finalmente, achamos que o sistema de tampão usado para aplicação dos compostos tem um efeito significativo sobre o desempenho do ensaio. 12 -atualmente, HBSS buffer é usado porque resulta no menor efeito sobre os níveis de glicose do sangue do embrião.
Para futuras aplicações, sistemas de reserva adicionais como uma alternativa ao HBSS podem ser testados. Além disso, a influência de extratos de plantas medicinais em parâmetros adicionais de sangue, como colesterol, triglicérides ou lipoproteínas pode ser uma pergunta atraente.
Nosso novo sistema no ovo é uma ferramenta importante e promissor para testar substâncias com características insulino-mimética em um organismo vivo sem a necessidade de uma experiência animal. Portanto, ele preenche a lacuna entre abordagens in vitro e in vivo . Em comparação com os existentes no ovo modelo sistemas17 não há nenhuma necessidade para induzir diabetes por tratamento de estreptozotocina (STZ), como nós usamos os embriões no dia 10 ou 11 de incubação. Nesta fase, não se tenha iniciado a produção de insulina, mas os embriões já são sensíveis de insulina. Além disso, permissão por uma Comissão de ética pode ser necessário se embriões com idades entre 14-17 dias são usados17. Além disso, em comparação com estratégias alternativas18, o aplicativo composto conforme descrito aqui é menos prejudiciais e laborioso, aumentando as taxas de através de-colocar experimentais.
Tomados em conjunto, esta no ovo abordagem é um sistema atraente se um efeito de diminuição de sangue de uma substância insulino-mimética precisa ser testado em um organismo vivo.

Diabetes mellitus é uma doença metabólica caracterizada por hiperglicemia e é causada por defeitos na secreção de insulina ou de ação de insulina1. Noventa por cento de todos os casos de diabetes são categoria diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), onde os indivíduos demonstram resistência à insulina e principalmente insulina deficiência2. Vários fatores são conhecidos por aumentar a incidência global de T2DM, incluindo mudanças de estilo de vida, particularmente as relacionadas com overnutrition, Envelhecimento e sedentarismo. Cerca de 400 milhões de pessoas têm diabetes mellitus em todo o mundo de acordo com a Federação Internacional de Diabetes (IDF). Esse número deve chegar a 600 milhões dentro os próximos 20 anos3.
Complicações do diabético causadas por hiperglicemia e resistência à insulina, tais como hipertensão arterial, dislipidemia, intolerância à glicose, doença coronariana e doença vascular cerebral, levam a um significativamente reduzida expectativa de vida e de qualidade4. Indivíduos afetados requerem farmacoterapia reduzindo a glicose; no entanto, o uso de drogas, como a metformina5 é frequentemente associado com efeitos colaterais dramáticos6,7,8. Portanto, mais antidiabéticos abordagens que são seguros, amplamente disponível e barato são necessárias.
Nutracêuticos, extratos, plantas e compostos de ervas diferentes tenham sido atribuídos Propriedades insulino-mimética característica modulando várias funções celulares. Uma característica importante é a estimulação de translocação do transportador de glicose (GLUT4) de 4 para a membrana plasmática de compartimentos de armazenamento intracelular, resultando em um aumento da absorção de glicose no músculo e tecido adiposo, na ausência de insulina, conhecida como Propriedades insulino-mimética9. Anteriormente, nós implementamos uma abordagem baseada em microscopia de fluorescência para quantificar o processo de translocação de GLUT410. Análise de numerosos extractos de plantas de uma biblioteca de extrato11 usando este ensaio resultou na identificação de candidatos promissores. No entanto, testes em organismos vivos são necessários. A abordagem descrita detalhadamente neste trabalho, um modelo de embrião de pintinho modificados, provou para ser um modelo promissor para a identificação de substâncias com propriedades insulino-mimética. Representa uma ferramenta atraente, enchendo o abismo entre os estudos in vitro e in vivo e oferece várias vantagens em comparação com sistemas existentes, tais como custos aceitáveis, procedimentos de manuseio simples e taxas de transferência adequada. Além disso, a permissão por uma Comissão de ética não é necessária.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:140px;">Biochrom</td>
			<td style="width:123px;">L1825</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovoRapid</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>8-0905-82-304-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)</td>
			<td>Local Breeder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check performa</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6454011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check Inform II Teststreifen</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>5942861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator&#160; HEKA- Turbo 288</td>
			<td>HEKA Brutger&#228;te</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe Omnican F 1 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>09161502S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extracts</td>
			<td>PEKISH extract library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp Tempo Nr. 119</td>
			<td>ORBAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds

Níveis elevados de glicose no diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), uma doença metabólica complexa e multifatorial, são causados por falha de resistência e β-célula de insulina. Várias estratégias, incluindo a injeção de insulina ou o uso de medicamentos insulino-sensibilizantes, foram perseguidas para tratar T2DM ou pelo menos reduzir os sintomas. Além disso, a aplicação de compostos à base de plantas tem atraído cada vez mais atenção. Assim, é preciso encontrar sistemas de teste eficiente para identificar e caracterizar compostos insulino-mimética. Aqui nós desenvolvemos um modelo de embrião de pintinho modificados, que permite testes de compostos sintéticos e extractos de ervas com propriedades insulino-mimética. Usando uma fluorescência baseado em microscopia tela primária, que quantifica a translocação do transportador de glicose (Glut4) de 4 para a membrana plasmática, fomos capazes de identificar compostos, principalmente extratos de ervas, que levam a um aumento de glicose intracelular concentrações nos adipócitos. No entanto, a eficácia destas substâncias requer mais verificação em um organismo vivo. Assim, usamos uma abordagem no ovo para identificar suas propriedades de redução de glicose do sangue. A aprovação por um Comitê de ética não é necessário desde que a utilização de embriões de galinha durante os primeiros dois terços do desenvolvimento embrionário não é considerada um experimento animal. Aqui, a aplicação deste modelo é descrita em detalhes.

Descrição da abordagem Glic-HET:
Após a incubação com as substâncias de interesse, os ovos fertilizados são abertos e preparados para coleta de sangue pela remoção da casca da ovo (Figura 2). Preparação adicional inclui a equilibração e a remoção da membrana da casca de ovo para obter acesso à membrana corioalantoicas. Esta membrana é então cortada cuidadosamente para fornecer acesso a um vaso sanguíneo adequado para coleta de sangue. De preferência, o grande navio proveniente do abdômen do embrião é colocado em uma pH-tira de plástico. Para evitar a diluição do sangue durante a coleta, o vaso e tira de pH é deu um tapinha seco com papel de filtro. O vaso sanguíneo é então cortado e sangue vazando a faixa de pH é recolhida para análise usando uma pipeta.
Efeitos de extratos de ervas selecionados sobre níveis de glicose no sangue:
Com uma recém criada translocação de GLUT4 baseada em quantificação tela primária, nós somos capazes de identificar as substâncias com um característico insulino-mimética10. Rastreio de centenas de extratos de ervas Water-soluble resultou na identificação de vários hits. Estes extratos foram testados em nosso modelo de ovo em. Extratos preparados a partir de Combretum indicum (trepadeira de Rangoon) e um extrato não-divulgado (denominado extrato 0845) foram usados para estes experimentos. Nós dissolvido os extratos em buffer HBSS a 300 mg/L, uma concentração que acabou por ser apropriado em anteriores estudos12,13. Substâncias foram aplicadas para os embriões incubados durante 11 dias. Conforme indicado na Figura 3, o extrato da trepadeira de Rangum não resultou em uma glicose de sangue significativa redução no ovo. No entanto, a concentração de glicose do sangue foi reduzida com sucesso com extrato 0845, com uma diminuição menor após 60 min, que é comparável ao efeito observado usando um análogo de insulina comercialmente disponível. Observou-se um efeito significativo quando se prolongou o tempo de incubação dos ovos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> Figura 1: influência de compostos tóxicos na vitalidade do embrião. Ovos foram incubados durante 11 dias (A e C) ou tratados com um extrato de ervas tóxico no dia 10 para outro 24h (B e D). Aplicação do extrato levou a graves lesões dos vasos sanguíneos da membrana corioalantoicas (D) e o embrião (B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> Figura 2: Descrição do modelo no ovo . Da esquerda para a direita: abertura e remoção da casca da ovo (1 - 2); equilibrio e remoção da membrana da casca de ovo com membrana corioalantoicas expostos (3); vaso preparado em uma faixa de pH (4); a coleta de sangue e medição da concentração de glicose, usando um medidor de glicose (5). Adaptado de Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> Figura 3: efeito de extratos de ervas sobre níveis de glicose em comparação com ovos não tratados ou tratada com insulina. Os ovos foram incubados durante 11 dias e tratados com as substâncias indicadas (análogo de insulina comercialmente disponível: 3.3 U/mL; extractos: 300 mg/L) dissolvido em tampão HBSS (volume de 300 µ l) para até 3 h. sangue os níveis de glicose foram determinados usando um medidor de glicose do sangue. Os resultados são mostrados sem o efeito do buffer. Barras de erro são baseadas no erro padrão da média. * P < 0,05 e * * * P < 0,0001, significativa diminuição em relação a ovos de HBSS-tratado ao mesmo tempo de incubação. Adaptado de Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Neste estudo, descrevemos um sistema no ovo como uma ferramenta promissora para testar compostos insulino-mimética em um organismo vivo. As principais vantagens incluem taxas de transferência adequada e a custos aceitáveis, que permitam a identificação de fitoquímicos com propriedades insulino-mimética.

Um modelo em Ovo para testar compostos insulino-mimética

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

an-in-ovo-model-for-testing-insulin-mimetic-compounds

Nanyang Technological University

Research

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JoVE Journal

Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Insulin and Hypoglycemic Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

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Vídeo: An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Neurociência

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Concepção e montagem de um Microdrive Ultra-leve motorizada para doenças crônicas Recordings Neurais em Pequenos Animais

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Um Ensaio Comportamental simples para Teste de Função Visual em<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Electrocorticographic Recording of Cerebral Cortex Areas Manipulated Using an Adeno-Associated Virus Targeting Cofilin in Mice

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. Adeno-associated viruses (AAVs) are increasingly used to improve understanding of brain circuits and their functions. The AAV-mediated manipulation of specific cell populations and/or of precise molecular components has been tremendously useful to identify new sleep regulatory circuits/molecules and key proteins contributing to the adverse effects of sleep loss. For instance, inhibiting activity of the filamentous actin-severing protein&#160;cofilin&#160;using AAV prevents sleep deprivation-induced memory impairment. Here, a protocol is&#160;described that combines the manipulation of cofilin function in a cerebral cortex area with the recording of ECoG activity to examine whether cortical cofilin modulates the wakefulness and sleep ECoG signals. AAV injection is performed during the same surgical procedure as the implantation of ECoG and electromyographic (EMG) electrodes in adult male and female mice. Mice are anesthetized, and their heads are shaved. After skin cleaning and incision, stereotaxic coordinates of the motor cortex are determined, and the skull is pierced at this location. A cannula prefilled with an AAV expressing cofilinS3D, an inactive form of cofilin, is slowly positioned in the cortical tissue. After AAV infusion, gold-covered screws (ECoG electrodes) are screwed through the skull and cemented to the skull with gold wires inserted in the neck muscles (EMG electrodes). The animals are allowed three weeks to recover and to ensure sufficient expression of cofilinS3D. The infected area and cell type are verified using immunohistochemistry, and the ECoG is analyzed using visual identification of vigilance states and spectral analysis. In summary, this combined methodological approach allows the investigation of the precise contribution of molecular components regulating neuronal morphology and connectivity to the regulation of synchronized cerebral cortex activity during wakefulness and sleep.

This article describes a protocol for the manipulation of molecular targets in the cerebral cortex using adeno-associated viruses and for monitoring the effects of this manipulation during wakefulness and sleep using electrocorticographic recordings.

Registro eletrocorticográfico de áreas do córtex cerebral manipulado usando um vírus associado ao Adeno visando cofilina em camundongos

The use of electrocorticographic (ECoG) recordings in rodents is relevant to sleep research and to the study of a wide range of neurological conditions. ...

Um modelo em Ovo para testar compostos insulino-mimética

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Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Concepção e montagem de um Microdrive Ultra-leve motorizada para doenças crônicas Recordings Neurais em Pequenos Animais

Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Um Ensaio Comportamental simples para Teste de Função Visual em

Um

Simultâneo

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

Registro eletrocorticográfico de áreas do córtex cerebral manipulado usando um vírus associado ao Adeno visando cofilina em camundongos