Agradecemos o Instituto de ciências biomédicas da UBC (LSI) Imaging Facility para apoiar e manter o microscópio STED. Este trabalho foi financiado por grant #68865 dos institutos canadenses de pesquisa em saúde (M.R.G.). Agradecemos o Dr. Kozo Kaibuchi (Universidade de Nagoya, Nagoya, Japão) para o plasmídeo CLIP-170-GFP.

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pela Universidade de British Columbia Animal conta Comité.
1. expressar proteínas GFP-fusão células A20 B-linfoma
<ol><li>Células de cultura A20 em completar meio RPMI (RPMI-1640 suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), 50 µM 2-Mercaptoetanol, glutamina 2mm, piruvato de 1 mM, 50 penicilina U/mL e 50 µ g/mL Estreptomicina) a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos com 5 % CO2.</li>
	<li>Preparar o reagente de transfeccao (consulte a Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Este protocolo foi otimizado para os reagentes específicos e protocolo do transfection descrito na Tabela de materiais. Outros reagentes de transfecção que tentamos não deram suficiente eficiência do transfection.</li>
	<li>Conte as células usando um hemocytometer. Centrífuga de 2.5 x 106 A20 células (para cada transfeccao) durante 5 min à x 525 g. Ressuspender as células em 100 µ l de reagente de transfeccao contendo de 1 a 2,5 µ g do ADN do plasmídeo. Para DNA codificação CLIP-170-GFP23, use 2,5 µ g por transfecção. Misture suavemente.</li>
	<li>As células de transferência de um bem de uma placa de 6 e ajustar o volume de 2 mL com o meio RPMI pré-aquecido completo. Cultura de células para 18 h a 37 ° C, para permitir a expressão da proteína.</li>
</ol>2. isolar células primárias do B e ativando-os com LPS
<ol><li>Use esterilização de instrumentos cirúrgicos para remover o baço de um rato, seguindo o protocolo aprovado pelo Comitê de cuidado Animal da instituição.</li>
	<li>O capuz de cultura de tecidos, coloque um coador de pilha de estéril 70-µm em um prato de cultura de tecidos de 35mm contendo 3 mL de PBS estéril de temperatura. Use a parte de borracha do êmbolo de uma seringa de 5 ml para esmagar o baço através do filtro de célula.</li>
	<li>Pipetar a suspensão única célula de splenoctyes em um tubo estéril 15 mL e centrifugar 525 x g por 5 min.</li>
	<li>Uso um isolamento magnético baseado em grânulo de células B kit (veja a Tabela de materiais) para obter uma população altamente enriquecida de células B.</li>
	<li>Ressuspender as células B de 3 x 106/mL em meio RPMI completo suplementado com 2,5 µ g/mL LPS mais 5 ng/mL B célula ativando o fator (BAFF; uma citocina de sobrevivência).</li>
	<li>Cultura de células para hr 6 a 37 ° C.</li>
</ol>3. revestimento as lamelas de vidro com anticorpos Anti-Ig
<ol><li>Prepare a solução de anticorpo para revestir as lamelas. Diluir a solução-mãe de anticorpos Ig de cabra anti-mouse em PBS estéril de temperatura ambiente para fazer uma solução de 12,5 µ g/mL; 400 µ l de solução de anticorpo é necessária para cada lamela. Nota: Use o cabra anti-mouse IgG para células A20; Use o cabra anti-mouse IgM para primário de células B. Anticorpos IgG cabra não se ligam bem a receptores de Fc de rato. No entanto, para evitar qualquer potencial ligação ao receptor Fc, um pode usar F(ab) ou F(ab')2 fragmentos do anti-mouse IgG ou anticorpos de IgM antirato.</li>
	<li>Mergulhe uma lamela de vidro redondo-18mm #1.5 em metanol 100% e deixe secar completamente (~ 10 min).</li>
	<li>Usando a pinça, coloca a lamela seca para uma cultura de tecidos de 12 poços placa e pipetar 400 µ l da 12,5 µ g/mL anticorpo solução (5 µ g total; 2 µ g/cm2) no sentido da lamela para que forma uma bolha no centro da lamela e se espalha para as bordas.</li>
	<li>Tenha cuidado para cobrir a lamela toda, mas não permitem a solução de anticorpo para ultrapassar a borda da lamela de vidro e em plástico a cultura de tecidos. Incube a temperatura ambiente por 30 min.</li>
	<li>Lave as lamínulas por pipetagem 1 mL de PBS estéril para o bem e, posteriormente, aspirar a solução. Repita mais duas vezes para remover anticorpos não acoplados.</li>
	<li>Adicione 1 mL de PBS estéril para o bem que contém a lamela de anticorpo-revestido até células estão prontas para serem adicionados. Nota: As lamelas podem ser mantidas em temperatura ambiente, coberta com PBS, para uso no mesmo dia.</li>
</ol>4. as células B se espalhando em lamelas Anti-Ig-revestido
<ol><li>Prepare-se modificado tampão HEPES salina (mHBS): 25mm HEPES, pH 7.2, 125 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1mm Na2HPO4, 0,5 mM de MgSO4, glicose de 1 mg/mL, glutamina 2mm, piruvato de sódio de 1 mM e 50 µM 2-Mercaptoetanol). Filtro de esterilizar esta solução e armazenar a 4 ° C.</li>
	<li>No dia do experimento, fazer 50 mL de mHBS com 2% FBS (mHBS-FBS), adicionando 1 mL de FBS inactivadas pelo calor para 50 mL mHBS. Aquecer as mHBS-FBS a 37 ° C antes do uso.</li>
	<li>Centrifugar as células A20 transfectadas ou as células B primárias que tinham sido cultivadas com BAFF além de LPS em 525 x g durante 5 min.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1 mL de mHBS-FBS, contar as células usando um hemocytometer e diluir as células de 2 x 105 células/mL em mHBS-FBS.</li>
	<li>Usando fórceps, transferi a lamela da placa de cultura de tecido para um pedaço de filme de parafina.</li>
	<li>Adicione 250 µ l de células B (5 x 104 células) para cada lamela.</li>
	<li>Incube as lamelas a 37 ° C por 15 min no escuro para permitir que as células B espalhar sobre a superfície anti-IgG-revestido.</li>
</ol>5. fixação e Immunostaining as células
<ol><li>Prepare a solução de fixação diluindo a solução estoque de paraformaldeído 16% e a solução de reserva de 50% de glutaraldeído em água à temperatura água destilada para produzir concentrações finais de 3% paraformaldeído e 0,1% de glutaraldeído. Prepare a solução de fixação no dia é para ser usado e descartar qualquer excesso. Atenção: As soluções estoque paraformaldeído e glutaraldeído só devem ser usadas em uma coifa de química. Siga as instruções na folha de dados de segurança material (MSDS).</li>
	<li>Preparar o buffer de permeabilização/bloqueio (BSA 3% e 0,1% Triton X-100 diluído em PBS). Filtro de esterilizar esta solução e armazenar a 4 ° C. No dia do experimento, aquecer a quantidade necessária à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare o buffer de coloração (1% BSA e 0,1% saponina em PBS). Esterilizar esta solução usando um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C. No dia do experimento, aquecer a quantidade necessária à temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipeta 350 µ l da solução de fixação no sentido cada lamela, garantindo que a superfície está completamente coberta. Incube a temperatura ambiente por 10 min no escuro.</li>
	<li>Remova a solução de fixação de lamela aspirando cuidadosamente da borda da lamela usando uma micropipetas. Atenção: A solução de fixação deve ser eliminada como resíduos químicos perigosos.</li>
	<li>Lave as lamínulas uma vez com 500 µ l de tampão de permeabilização/bloqueio. Pipetar o líquido.</li>
	<li>Permeabilize e bloquear as células adicionando 250 µ l de tampão de permeabilização/bloqueio para cada lamela, e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Dilua a 1: 100 do anticorpo antitubulina coelho de coloração, o tampão.</li>
	<li>Aspire o buffer permeabilização/bloqueio das lamelas e adicionar 50 µ l da solução diluída anticorpo antitubulina para cada lamela. Incube a temperatura ambiente por 30 min no escuro.</li>
	<li>Prepare a solução de mancha do anticorpo secundário/actina diluindo o anticorpo secundário da Alexa Fluor 532-conjugados cabra anti-coelho IgG e Alexa Fluor 568-conjugados faloidina 1: 100 de coloração, o tampão.</li>
	<li>Lave as lamelas 3 vezes para remover o excesso anticorpo primário adicionando 500 µ l de tampão de coloração e em seguida por aspiração.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de solução de mancha do anticorpo secundário/actina para cada lamela e incube por 30 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lave as lamelas 3 vezes para remover o excesso anticorpo secundário adicionando 500 µ l de tampão de coloração e em seguida por aspiração.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de reagente de montagem para uma lâmina de microscópio. Monte a lamela sobre a lâmina de microscópio com o lado da célula para baixo. Nota: Um meio de montagem de "anti-fade" (ver Tabela de materiais) é altamente recomendável para preservar a intensidade da fluorescência das proteínas da fusão de GFP. Evite o uso de reagentes contendo DAPI, que pode interferir com a imagem do fluorophores quando usando o laser STED de montagem.</li>
	<li>Permitir que os slides para secar durante a noite no escuro. Os slides da imagem no dia seguinte. Nota: Os slides de imagem, tão logo a lamela é seca é altamente recomendável, como a fluorescência de GFP irá diminuir ao longo do tempo.</li>
</ol>6. geração de imagens usando o microscópio STED
Nota: Por favor, note que todos os passos de software descritos abaixo são específicos para o microscópio e o software utilizados (consulte a Tabela de materiais). Os passos e configurações precisará ser ajustado se a imagem é executada usando um microscópio/software diferente.
<ol><li>Ligue o microscópio STED, ativar o laser e a lâmpada de iluminação de epifluorescência e iniciar o software do microscópio.</li>
	<li>Defina os parâmetros para os lasers de depleção STED. Nota: Isso vai depender o microscópio específico a ser usado e os lasers que é dotado. Algumas recomendadas configurações são a luz branca (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%.</li>
	<li>Activar as definições de STED e alinhar os raios de laser STED usando o objectivo X 100.</li>
	<li>Usando a ocular, concentrar a amostra e selecionar uma célula com expressão moderada de GFP. Nota: A expressão baixa GFP não será visível porque STED reduz a intensidade de emissão. Por outro lado, alta expressão de CLIP-170-GFP induz a formação espontânea de grandes aglomerados, que não reflete o normal microtubule plus-final proteína complexa morfologia e distribuição. Selecionando uma célula com expressão moderada de GFP é essencial para imagens com precisão as estruturas do citoesqueleto no local de contato do antígeno.</li>
	<li>Zoom em célula selecionada e escolha a região de interesse para ser fotografada. Ajuste o foco para que no plano x-y da célula B que está mais próximo da lamela está em foco.<ol>
<li>Para fazer isso, mova o objectivo progressivamente mais perto para a lamela para que as estruturas do citoesqueleto da célula B entram em foco e depois ir fora de foco. Então gradualmente mover o objetivo na direção oposta, até as estruturas do citoesqueleto da célula B primeiro voltar em foco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Otimize as configurações, incluindo o poder do laser, feixe de excitação e gama do detector. Iniciar com as configurações recomendadas pelo fabricante. Fazendo ajustes necessários para otimizar o sinal para as amostras. Todas as amostras para ser comparado com os outros com as mesmas configurações da imagem.</li>
	<li>Sob a aba "adquirir" do software, como a aquisição de imagem aquisição sequencial de quadro no painel do canto inferior esquerdo "Varredura sequencial" marcando a opção "entre quadros".</li>
	<li>Defina a sequência de aquisição. Nota: Adquirimos a fluorescência de GFP primeiro para evitar a degradação do sinal de GFP. Dependendo da combinação de fluorophores usados além de GFP, imagem do sinal de fluorescência de comprimento de onda mais primeiro pode produzir melhores resultados. No entanto, a ordem em que os fluorophores ou proteínas fluorescentes são sujeitos ao esgotamento de emissão estimulada e fotografadas deve ser otimizada para obter os sinais de fluorescência mais fortes e melhor resolução.</li>
	<li>Selecionar e definir a potência do laser STED para cada fluoróforo sob a aba "Acquire" do software e use a barra deslizante para o 592-nm ou o laser STED 660 nm para ajustar a potência do laser. Ajuste a potência para o esgotamento de 592-nm laser para as boas práticas agrícolas e Alexa Fluor 532. Ajuste a potência do laser de 660 nm esgotamento para Alexa Fluor 568.</li>
	<li>Para aumentar a resolução e reduzir o sinal de fundo, vá para as configurações de "Aquisição" sob a aba "Acquire" do software, aumentar a linha e/ou quadro, em média, selecionando um valor maior que 1, usando o menu suspenso para cada opção.</li>
	<li>Também, adquirir o sinal fluorescente usando STED dependentes de tempo, verificando a opção associada para o fluoróforo sob a aba "Adquirir" e especificando valores para retenção de tempo (ver nota abaixo). Aumente a potência do laser STED para melhorar a resolução, embora isso também aumentará fotobranqueamento do fluorophores. Nota: O tempo associado precisará ser otimizado para o microscópio, amostra e fluorophores sendo usado. Um tempo de retenção de 0,3 a 6 ns é recomendado. Após a fixação, a GFP é particularmente sensível ao poder do laser de alta. Para reduzir o fotobranqueamento de GFP, tempo de retenção deve ser aplicada e a potência do laser STED deve ser reduzida.</li>
	<li>Para capturar imagens STED 3D, use o controle deslizante para alterar o ponto de espalhar função (PSF) para "STED 3D".</li>
	<li>Manualmente adquira várias imagens para garantir a reprodutibilidade. Deconvolve as imagens (ver Figura 1) usando um software de deconvolução pacote41(ver Tabela de materiais).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation.">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).</li><li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation.">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+B+cell+activation.">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling.">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts:+Synapses+and+Kinapses.">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse.">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses.">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses.">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunter+to+gatherer+and+back:+immunological+synapses+and+kinapses+as+variations+on+the+theme+of+amoeboid+locomotion.">Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+B+cells+capture,+process+and+present+antigens:+a+crucial+role+for+cell+polarity.">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li><li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk:+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling.">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li><li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing.">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1-cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor-mediated+antigen+gathering+requires+ubiquitin+ligase+Cbl+and+adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+recruit+dynein+to+the+signaling+microcluster.">B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster.</a> Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+Separately+Partners+with+NDE1+and+Dynactin+To+Orchestrate+T+Cell+Focused+Secretion.">Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion.</a> J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).</li><li>Combs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+dynein+to+the+Jurkat+immunological+synapse.">Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+organization+and+dynamics:+two+ends+in+the+limelight.">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule++TIPs+at+a+glance.">Microtubule +TIPs at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).</li><li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Cdc42+capture+microtubules+through+IQGAP1+and+CLIP-170.">Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170.</a> Cell. 109 (7), 873-885 (2002).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse.">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li><li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells.">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins.">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li><li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Lymphocyte+Migration:+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors.">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586 (2015).</li><li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+the+migration,+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas.">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology,+immune-synapse+formation,+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands.">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li><li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion,+cell+spreading,+actin+polymerization,+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes.">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li><li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation.">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity.">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li><li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling.">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li><li>Yuseff, M. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).</li><li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse.">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Imagens detalhadas das estruturas do citoesqueleto podem ser obtidas usando microscopia de super-resolução STED, que teoricamente pode alcançar uma resolução de 50 nm, em comparação com microscopia confocal convencional, para os quais a resolução de difração limitada é ~ 200 nm 24. a capacidade de resolver estruturas mais finas é reforçada por usando deconvolução software para calcular a posição mais provável da fonte de luz original do sinal de fluorescência "turva" observados. Este protocolo descreve métodos para usar STED a imagem o citoesqueleto de actina e microtúbulos, bem como proteínas de citoesqueleto associadas.
Ativação de células b induz a remodelação de ambos o citoesqueleto de actina e a rede de microtúbulos, com a regulação coordenada do dois citoesqueleto sendo importante para a formação de sinapse imunológica17,42. O método que apresentamos foi otimizado para imagens simultaneamente o citoesqueleto de actina e microtúbulos no local de contato do antígeno usando multi cor STED, mas é igualmente aplicável para STED cor única. Estudos anteriores que foi realizado sobre o destaque do citoesqueleto de células B que STED pode fornecer novos insights sobre estruturas celulares como estão organizados e como eles interagem uns com os outros. Utilizando microscopia confocal e total interno da fluorescência (TIRF), tinha-se observado que os microtúbulos entre em contato com o anel de F-Actina na periferia do antígeno contato local17. Usando microscopia STED, fomos capazes de mostrar que as extremidades mais de microtúbulos que foram marcados pelo + TIP CLIP-170 associar-se intimamente com a rede de actina dendríticas na periferia da célula (veja Figura 4).
Vários fatores influenciam a qual técnica de imagem é mais adequada para a aplicação específica. Estes incluem a resolução necessária, as estruturas para ser fotografada, a técnica de rotulagem e sua relação sinal-ruído (ou seja, contraste), tempo de aquisição, facilidade de preparação da amostra e reprodutibilidade. Preparação da amostra para STED não é significativamente diferente do que para a microscopia confocal, e combina alta resolução com aquisição de imagem rápida. Uma grande vantagem do STED é que é um processo óptico em que a imagem diretamente é adquirida a partir da amostra e a resolução pode ser ajustada alterando-se o poder do laser STED24. Ao contrário de microscopia de super-resolução de depleção estado fundamental, que reconstrói imagens de milhares de imagem sucessiva captura, extenso processamento computacional não é necessário para STED e evita-se a introdução de artefatos de reconstrução de imagem 24. no entanto, o contraste nas imagens STED é frequentemente baixo24, no qual caso processamento de pós-imagem usando software como o ImageJ pode ser necessária para realçar o contraste. Isto é particularmente importante para imagens com estruturas densas, como uma rede de actina dendríticas. Para melhorar o contraste da imagem durante a aquisição de imagens, um pode reduzir a potência do laser de esgotamento e/ou aplicar a linha ou o quadro em média. Tempo-dependentes STED, que capta os fótons após um atraso de tempo do usuário-definido, pode aumentar a resolução, diminuindo a área da qual os fótons são coletados24,43. Recomendamos otimizando a imagem STED de estruturas do citoesqueleto na sinapse imunológica por meio de uma combinação desses métodos para melhorar o contraste e resolução.
Atualmente, fluorophores nem todas são ideais para a imagem latente com STED, e nem todas as combinações de fluoróforo são adequadas para a obtenção de imagens STED multi cores. Ajuste cuidadoso dos intervalos de deteção é importante para garantir a infiltração mínima de fluorophores em canais adjacentes. A combinação de fluorophores utilizados neste protocolo (ou seja, as boas práticas agrícolas, Alexa Fluor 532 e Alexa Fluor 568) é ideal para a imagem latente de super-resolução STED multicolor. Em comparação com microscopia de iluminação estruturada (SIM) e métodos de localização de único-molécula (SMLM), tais como a microscopia de Localização foto-ativado (PALM), STED não é tipicamente ideal para geração de imagens de várias cor. No entanto, aqui mostramos essa saturação ligeira excesso de detecção de fluoróforo, emparelhado com simples ferramentas de processamento de imagem, pode entregar imagens de alta resolução de cores multi do citoesqueleto de actina e microtúbulos.
Este protocolo para a imagem latente de STED das estruturas do citoesqueleto revelou novos detalhes da arquitetura do citoesqueleto na célula B sinapse imunológica. Embora nós aperfeiçoamos o presente protocolo para o citoesqueleto de actina e microtúbulos no local em células B antígeno-contato de imagem, estes métodos devem ser aplicáveis a outros tipos de células, especialmente células imunes (linfócitos T, células NK, mastócitos, etc.) que formam sinapses imunes. Além disso, o utilitário do presente protocolo poderia ser estendido para revestimento de lamelas com outros ligantes ou substratos adesivos. No entanto, é importante otimizar o protocolo e as configurações de aquisição de imagem para o tipo de célula e a montagem experimental.

Quando as células B vincular a polarizada matrizes de antígenos (por exemplo, exibido na superfície do antígeno-apresentando células (APCs)), o resultante receptor de células B (BCR) sinalização drives a formação de uma estrutura clássica sinapse imunológica, que foi primeira descrita em T células1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inicialmente, microclusters de antígeno-limite BCRs verbo na periferia da célula B: APC contato local. Estes microclusters, em seguida, mover em direção ao centro do site contato antígeno, onde se fundirem em um cluster de activação supramolecular central (cSMAC) que forma o núcleo da sinapse imunológica. Formação de sinapse imunológica otimiza BCR sinalização e facilita a extração de BCR-mediada do antígeno de membrana APC14. Esta aquisição do antígeno, que é seguida por internalização mediada por BCR antígeno e processamento do antígeno subsequentes, permite que as células B apresentar peptídeo: MHC complexos II para células T e obter ajuda de células T14. Porque a formação de imune sinapse promove a ativação de células B, elucidar os mecanismos que estabelecem que este padrão funcional da organização do receptor pode fornecer novos insights sobre como humorais respostas imunes são iniciadas e regulamentadas.
Reorganização do citoesqueleto de actina e microtúbulos é essencial para a formação de sinapse imunológica. BCR localizada sinalização estimulados por uma matriz espacialmente polarizado de antígenos induz rápida e dramática que remodela o citoesqueleto de actina1,15. A formação de estruturas dendríticas actina na periferia da célula B exerce forças empurra na membrana plasmática e promove a disseminação de células B. Isto permite que a célula B para fazer a varredura de uma área maior da superfície do antígeno-rolamento e aumenta o número de BCRs que ligam o antígeno e ativar BCR vias de sinalização. Ao mesmo tempo, o MTOC e a rede de microtúbulos são reorientados para o local de contato do antígeno. Como o MTOC aproxima-se o local de contato do antígeno, microtúbulos emana o MTOC se estendem ao longo da face interna da membrana plasmática na interface entre a célula B e a superfície do antígeno-rolamento16,17. Estes microtúbulos juxtamembrane podem então agir como faixas para o movimento centrípeto mediada por Dineína de antígeno-limite BCR microclusters18, levando à formação de um cSMAC.
A reorientação e a polarização do MTOC no sentido da sinapse imunológica requer actina intacta e citoesqueleto do microtúbulo e muitas vezes depende de interações entre o actin cortical rede e microtúbulos16,17, 19,20. Proteínas de ligação de actina corticais, como IQGAP1, podem capturar os microtúbulos interagindo com complexos de proteína que decoram o microtubule mais fins-de-21. Estes dinâmicos complexos de proteínas plus-final incluem EB1 e CLIP-170, que são coletivamente referidos como microtubule plus-final rastreamento proteínas (+ dicas)21,22. + Dicas nas extremidades dos microtúbulos podem ligar às proteínas que estão associadas com a membrana plasmática ou o citoesqueleto de actina cortical. Isso permite que os mecanismos de geração de força (por exemplo, o subtração-final dirigido movimento de Dineína corticalmente ancorada ao longo de microtúbulos) exercer forças de tração sobre os microtúbulos, e desse modo reposicionar o MTOC. CLIP-170 pode ligar à proteína associada a actina andaimes IQGAP123, e mostramos que ambos destas proteínas são necessários para a polarização induzida por BCR MTOC em direção a sinapse imunológica17. Essa interação IQGAP1-clipe-170 pode desempenhar um papel fundamental na coordenação a remodelação do citoesqueleto de actina com o reposicionamento da rede microtubule a sinapse imunológica célula B.
Microscopia de fluorescência convencional revelou a reorganização dramática do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a célula B sinapse imune formação2. No entanto, esta abordagem não pode resolver pequenas estruturas celulares em detalhe devido o limite de difração de luz, que, de acordo com a lei do Abbe, depende do comprimento de onda de luz que serve para iluminar a amostra e a abertura do objetiva24. Este limite de difração restringe a resolução dos microscópios de luz convencionais para 200-300 nm no sentido lateral e 500-700 nm na direção axial25. Portanto, menores estruturas subcelulares, bem como os detalhes do citoesqueleto de actina e microtúbulos, poderiam apenas ser observados usando microscopia eletrônica. Imagem de microscopia eletrônica do citoesqueleto é demorada, exige protocolos de fixação e preparação amostra dura que podem alterar estruturas biológicas e é limitado à detecção do anticorpo-negociada. A capacidade de delgados e simultaneamente várias proteínas de imagem ou estruturas celulares é uma vantagem substancial de microscopia de fluorescência. Além disso, expressar proteínas da fusão fluorescente em células permite a geração de imagens em tempo real e é útil quando não existem anticorpos eficazes para immunostaining da proteína de interesse.
Recentes avanços tecnológicos em microscopia de super-resolução superaram os limites de difração de luz e permitiu a visualização de estruturas celulares de nanoescala24. Uma tal técnica de microscopia de super-resolução chama-se microscopia de depleção (STED) emissão estimulada. STED emprega dois lasers, onde um laser excita o fluoróforo e um segundo laser com um padrão em forma de donut seletivamente suprime a emissão de fluorescência em torno do fluoróforo. Isto reduz a função de ponto-propagação (área aparente) de uma única partícula fluorescente e fornece um sub difração limite imagem fluorescente25,26. Microscopia de esgotamento do solo-estado também emprega técnicas baseadas em fluorescência para adquirir imagens de super-resolução. No entanto, os tempos de aquisição e reconstrução de imagem são longos, há apenas um número limitado de fluorophores que pode ser usado, e a imagem de alta resolução simultânea de vários componentes do citoesqueleto é tecnicamente desafiador porque manter estruturas de actina e microtúbulos requer procedimentos de fixação diferentes. Portanto, STED tem várias vantagens sobre microscopia eletrônica e outra microscopia de super-resolução se aproxima em que oferece aquisição de imagem rápida, tem requisitos mínimos de pós-processamento e emprega a mesma fluorophores e técnicas de coloração que são utilizados para microscopia de fluorescência convencional de amostras fixas26.
Microscopia de super-resolução agora tem sido utilizada para visualizar estruturas de actina na sinapse imunológica em assassino naturais (NK) células e T células26,,27,28,29,30, 31. no entanto, imagem de super-resolução de citoesqueleto do microtúbulo, bem como a reorganização coordenada do citoesqueleto de actina e microtúbulos durante a formação da sinapse imunológica, só foi recentemente relatado17. Nós costumávamos microscopia STED células de imagem B que tinham sido autorizadas a espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos que estimulam a BCR sinalização e iniciar a reorganização do citoesqueleto. Quando banhado em imobilizado anticorpos anti-Ig, células B submeter-se dramática dependente de actina se espalhando, que recapitula os eventos iniciais durante a formação da sinapse imunológica. Importante, microscopia STED revelou os detalhes do anel dendrítica de F-Actina que formulários na periferia de imune a sinapse e mostraram que o MTOC, bem como os microtúbulos ligados a ela, havia se mudado perto o antígeno contato local17. Estes microtúbulos estendido para fora para o anel periférico de F-Actina. Além disso, imagens de STED multi cor de várias combinações de F-Actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etiquetado CLIP-170 + dicas mostraram que microtubule mais fins-de-marcados pelo CLIP-170-GFP eram intimamente associados com a malha de actina periférica e com IQGAP1, um proteína de captura cortical17.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o citoesqueleto de actina e microtúbulos na sinapse imune usando microscopia STED de imagem. Esses métodos foram otimizados usando a linha de murino B célula A20, que tem sido amplamente utilizada para estudar a sinalização BCR e sinapse imune formação17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. porque anticorpos comerciais para CLIP-170 não funcionou bem para immunostaining em experiências anteriores, descrevemos em detalhe a expressão de GFP-etiquetado CLIP-170 nas células A20, juntamente com protocolos para a visualização em simultâneo de até de coloração três componentes do citoesqueleto ou proteínas de citoesqueleto associadas. Métodos para usando microscopia STED actina imagem em sinapses imunes do NK células têm sido descritos anteriormente40. Aqui, podemos estender esta para aquisição de imagens de resolução super multi cor do citoesqueleto de actina e microtúbulos nas células B.
Uma consideração crítica para microscopia de super-resolução é usando os procedimentos de fixação adequadas para a manutenção de estruturas celulares e prevenção de danos às proteínas fluorescentes. A fixação e coloração métodos aqui apresentados foram otimizados para reter a fluorescência de GFP e fornecer imagens de alta resolução das redes de actina e microtúbulos. Quando expressar proteínas fluorescentes, deve notar-se que as células B são geralmente difíceis de transfect. Usando este protocolo, 20-50% de A20 células geralmente expressam a proteína de fusão de GFP transfectada, e entre esta população, os níveis de expressão da proteína são variáveis. Não obstante, imagem latente de super-resolução de actina e microtúbulos usando os procedimentos que descrevemos é bastante robusto e imagens de alta qualidade são facilmente obtidas. Apesar de seu tamanho pequeno em relação as células A20, mostramos que esses procedimentos também podem ser usados para a rede de microtúbulos na primárias células B que foram ativados brevemente com lipopolissacarídeo (LPS) de imagem. Temos demonstrado que as células B primárias LPS-ativado podem ser transfected com siRNAs com eficiência relativamente alta (ou seja, tal que a depleção de proteína pode ser detectada pelo immunoblotting), tornando-os uma boa alternativa para o uso de linhas de células B para alguns estudos 17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20 mouse B-lymphoma cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-208</td>
			<td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;R0883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>Heat inactivate at 56 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G5763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Liquid, 10,000 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional materials for primary B cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead-based B cell isolation kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19854</td>
			<td>EasySep Mouse B cell Isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS from E. coli 0111:B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B cell-activating factor (BAFF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2106-BF-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid encoding CLIP-170-GFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata et al. Cell 109:873-885, 2002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recommended transfection reagents and equipment </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofection kit V</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1003</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Nucleofector model 2b</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAB-1001</td>
			<td>Program L-013 used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 6-well plates, TC treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18-mm diameter round #1.5 cover glasses</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1217N81</td>
			<td>Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1381242</td>
			<td>Dissecting extra fine splinter forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-008</td>
			<td>For A20 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-005-020</td>
			<td>For primary mouse B cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% stock solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute with PBS to working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (50% stock solution)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>340855</td>
			<td>Dilute with PBS to working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), Fraction V</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52866</td>
			<td>1:250 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11009</td>
			<td>1:100 dilution recommended but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12380</td>
			<td>1:100 dilution recommneded but should be optimized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td>Without DAPI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P1150-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens deconvolution software</td>
			<td>Scientific Voume Imaging</td>
			<td></td>
			<td>See https://svi.nl/HuygensProducts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy

Células B que se ligam aos antígenos de membrana-limite (por exemplo, na superfície de uma célula apresentadora de antígeno) formam uma sinapse imunológica, uma estrutura celular especializada que otimiza a sinalização da B-pilha do receptor (BCR) e aquisição de antígeno BCR-mediada. A remodelação do citoesqueleto de actina e a reorientação da rede microtubule em direcção ao local de contato do antígeno são essenciais para a formação de sinapse imunológica. Remodelação do citoesqueleto de actina, em um anel periférico denso de F-Actina é acompanhada de polarização do centro em direção a sinapse imunológica microtubule-organizadora. Proteínas microtubule plus-final, bem como proteínas cortical plus-final captura mediam interações físicas entre o citoesqueleto de actina e microtúbulos, que lhes permite a ser reorganizado de forma coordenada. Elucidação dos mecanismos que controle Esta reorganização do citoesqueleto, bem como a compreensão de como essas estruturas do citoesqueleto forma formação sinapse imunológica e BCR sinalização, pode fornecer novos insights sobre a ativação de células B. Isto tem sido ajudado pelo desenvolvimento de abordagens de microscopia de super-resolução que revelam novos detalhes de organização da rede do citoesqueleto. Descrevemos aqui um método para usar microscopia de depleção (STED) emissão estimulada simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule GFP-etiquetado transfectadas plus-final nas células B. Para modelar os eventos iniciais na formação de sinapse imunológica, podemos permitir que as células B espalhar em lamelas revestidas com anti-imunoglobulina (anti-Ig) anticorpos, que iniciam a remodelação do citoesqueleto e sinalização de BCR. Nós fornecemos protocolos passo a passo para expressar proteínas da fusão de GFP nas células A20 B-linfoma de célula anti Ig-induzida por espalhamento e para fixação da pilha subsequentes, imunocoloração, aquisição de imagem e imagem deconvolução etapas. As imagens de alta resolução obtidas usando estes procedimentos permitem visualizar simultaneamente estruturas de actina, os microtúbulos e as proteínas de ligação plus-final microtubule que podem unir essas duas redes do citoesqueleto.

Para as pilhas de B se espalhando em imobilizado anti-Ig, microscopia STED usada em conjunto com software de deconvolução fornece imagens de alta resolução de estruturas do citoesqueleto de microscopia confocal. Isto é evidente na Figura 1, onde a rede de F-Actina foi visualizada usando o protocolo descrito acima. Uma comparação de confocal e imagens de super-resolução STED da mesma amostra mostra que as imagens STED são de resolução mais alta e revelam mais detalhadas estruturas do citoesqueleto de actina (Figura 1). Esta figura mostra também que deconvolução é essencial para a obtenção de imagens de alta qualidade STED qual actina filamentos mais claramente definidos. Apesar de deconvolução de imagens confocal produz uma melhoria substancial na resolução da imagem, imagens STED deconvolved fornecem informações estruturais mais detalhadas do que deconvolved imagens confocal. Em particular, a estrutura dendrítica do anel periférico F-Actina é revelada em maior detalhe por microscopia STED (Figura 1 e Figura 2). A rede de microtúbulos no local de contato do antígeno também foi fotografada usando a preparação da amostra e imagem protocolo descrito acima (Figura 3). Os microtúbulos se originam de um ponto central, que é o MTOC, e emanam para fora em direção a periferia da célula. Neste experimento, as células B foram autorizadas a espalhar em lamelas anti-Ig-revestido por 15 min (Figura 3), um ponto de tempo no qual o MTOC mudou-se para o antígeno contato local17. CLIP-170-GFP aglomerados que marcam as plus-extremidades dos microtúbulos podem ser vistos nas extremidades dos microtubules mostrados na Figura 3. Quando a preparação da amostra e a imagem de STED da rede microtubule é ideal, contínua e distintas microtúbulos são observados, com CLIP-170-GFP localizada ao longo de microtúbulos ou nas extremidades-plus (Figura 3A). Microtubule sub-ótimo coloração, que foi observada quando usando concentrações de anticorpos ou lotes de α-tubulina os anticorpos que são mais de um anos de idade, resulta em microtúbulos aparecendo como seções descontínuas que são mal resolvidas de coloração em cima de deconvolução (Figura 3B; ver também Figura 5). Apesar de tudo da fluorescência nestas imagens CLIP-170-GFP é associado com estruturas de α-tubulina-immunostained, um não pode distinguir se o CLIP-170-GFP está localizado nas extremidades mais, ou ao longo do comprimento dos microtubules, devido a coloração incompleta dos microtúbulos. Portanto, é importante que o anticorpo de α-tubulina armazenados sob o fabricante recomendado condições de armazenamento e usado dentro de um ano.
Usando este protocolo, imagens de STED de multi cores de alta qualidade que mostram a organização e estrutura do citoesqueleto de actina e a rede de microtúbulos, bem como as proteínas tais como IQGAP1 e CLIP-170 que associar estas duas citoesqueleto17, pôde ser adquirido. As imagens STED na Figura 4 mostram o anel periférico de actina dendrítica, bem como os microtúbulos que emanam de uma localização central na célula onde a coloração da actina é muito menos densa. CLIP-170-GFP nas extremidades destes microtúbulos está intimamente associada com a F-Actina periférica. Este protocolo permite visualizar estruturas do citoesqueleto na sinapse imune usando STED cor única imagem (Figura 2) ou multicolor STED imagiologia (Figura 3 e Figura 4). No entanto, deve notar-se que a única cor STED geração de imagens (Figura 2) pode produzir resolução melhor das estruturas de actina e os microtúbulos nas células B que STED multi cor (Figura 4). Isto pode ser devido fotobranqueamento causado pela aquisição de imagens sequencial STED para o diferente fluorophores. Para obter as melhores imagens de super-resolução, a combinação de fluorophores e proteínas fluorescentes selecionadas, bem como a sequência em que eles são imagens usando os lasers da excitação e prostração, deve ser otimizada para a amostra. Não obstante, imagem latente de STED multi cor fornece imagens de alta resolução destas estruturas do citoesqueleto do que convencional microscopia confocal. Além disso, cor única STED pode ser usado para adquirir imagens de super-resolução 3-dimensional da rede de actina ou microtubule toda a célula B (filme 1).
Quando usar células transfectadas com proteínas da fusão fluorescente, alcançando níveis de expressão ideal e evitar artefatos devido à superexpressão são considerações importantes. Nas células onde CLIP-170-GFP é overexpressed, formam-se grandes agregados de CLIP-170-GFP (Figura 5A). Além deste mislocalization do CLIP-170-GFP, apenas parte da rede do microtubule nesta cela estava situado no plano focal mais próximo para a lamela (Figura 5B). Isto sugere que CLIP-170 superexpressão também pode afectar a polarização induzida por BCR MTOC. Por outro lado, porque os sinais de forte fluorescência são normalmente exigidos para a aquisição de imagens de alta qualidade STED, baixa expressão de proteínas da fusão fluorescente como CLIP-170-GFP (Figura 5) resulta em imagens de má qualidade. Daí, quando usando células que têm sido transfectadas com proteínas fluorescentes, é importante a imagem somente as células com ótimos níveis de expressão da proteína de fusão. Também é importante notar que o protocolo de transfeccao que foi usado para A20 células (ver Tabela de materiais) geralmente resulta em 20-50% das células expressando a proteína transfectada. Por plasmídeo (ao contrário de siRNAs), frequências de Transfeccao para primário de células B são frequentemente muito mais baixo do que para as células A20, exigindo o uso de linhas de células B. No entanto, imagens de alta qualidade STED de elementos do citoesqueleto na untransfected de células B primário podem ser obtidas usando esse protocolo (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57028/57028fig1.jpg"> Figura 1: comparação de confocal STED imagem de F-Actina e. Imagens confocal (topo) e imagens STED (inferior) de uma célula A20 que espalhou-se em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser manchada com Alexa Fluor 532-conjugados faloidina. Usando o microscópio confocal de STED, a mesma célula foi fotografada primeiramente por microscopia confocal e depois por STED. O inicial confocal e imagens STED são mostradas, juntamente com o mesmo confocal e imagens STED depois deconvolução. Barra de escala: 5 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57028/57028fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57028/57028fig2.jpg"> Figura 2: O citoesqueleto de actina no local de contato do antígeno. Células A20 que tinham sido autorizadas a espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min foram coradas com Alexa Fluor 568-conjugados faloidina e fotografadas por microscopia STED. As imagens STED iniciais foram deconvolved. Painéis A-B e painéis C-E mostram imagens representativas de duas células diferentes. Painel E mostra um alargamento de X 3 da região na caixa branca no painel C. Barra de escala para os painéis A-D: bar 5 µm. escala para painel E: 1 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57028/57028fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57028/57028fig3.jpg"> Figura 3: imagens STED da rede de microtúbulos e CLIP-170-GFP. Células A20 expressando GFP-CLIP-170 foram autorizadas a espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser fixado e immunostained com um anticorpo de α-tubulina além de um anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 532. (A) imagem representativa mostrando immunostaining da rede de microtúbulos, com CLIP-170-GFP, localizado principalmente nas extremidades-adição de microtúbulos. (B) coloração sub-ótimo e resolução de microtúbulos devido ao uso de um estoque desatualizado de anticorpo de α-tubulina. Barras de escala: 5 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57028/57028fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57028/57028fig4.jpg"> Figura 4: imagens STED do citoesqueleto de actina e microtúbulos. Células A20 expressando GFP-CLIP-170 foram autorizadas a espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser fixadas e coradas com Alexa Fluor 568-conjugados faloidina Visualizar F-Actina e com um anticorpo de α-tubulina mais uma Alexa Fluor 532-conjugados anticorpo secundário para visualizar os microtúbulos. Painéis A-D e painéis E-F mostram imagens representativas de duas células diferentes. Painel D é um alargamento X 3.5 da região na caixa branca no painel C. Barras de escala: 5 µm para painéis A-C e E-F; 1 µm para painel D. A imagem no painel A é a mesma imagem usada na Figura 3A , mas inclui a sobreposição do canal F-Actina. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57028/57028fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57028/57028fig5.jpg"> Figura 5: exemplos de imagens de má qualidade STED devido à superexpressão ou insuficiente expressão da proteína de fusão do GFP. Células A20 expressando GFP-CLIP-170 foram autorizadas a se espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser fixo e manchado como na Figura 4. (A, B) Resultados do CLIP-170-GFP superexpressão em agregados grandes, anormais de CLIP-170-GFP (A) e prejudicada polarização MTOC para o contato do antígeno local (B). (C) compensando a expressão insuficiente de CLIP-170-GFP, aumentando os resultados de potência do laser em imagens de má qualidade STED. Barras de escala: 5 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57028/57028fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57028/57028fig6.jpg"> Figura 6: imagem STED do citoesqueleto microtúbulos nas células primárias de B. Pilhas de B splenic primárias foram cultivadas para 6 h com 5 ng / µ l BAFF plus 2,5 µ g/mL LPS e então autorizadas a espalhar-se por 15 min em lamelas que tinham sido revestidas com anticorpos anti-IgM. As células foram fixados e corados com um anticorpo de α-tubulina e um anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 568 Visualizar microtúbulos mais. É mostrada uma imagem representativa. Barra de escala: 5 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57028/57028fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57028/57028video1.jpg"> Filme 1: reconstrução 3D da rede microtubule célula B. Células A20 foram autorizadas a se espalhar em lamelas anti-IgG-revestido por 15 min antes de ser fixado e immunostained com um anticorpo de α-tubulina além de um anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488. Z-fatias foram capturadas em 0,2 µm tamanhos de etapa para um total de 37 frames. Reconstrução 3D foi feita usar o microscópio STED é software de imagem. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57028/Movie_1-Wang.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Apresentamos um protocolo para o uso de microscopia STED simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule plus-final em células B que se espalharam em lamelas revestidas com anticorpos contra o receptor de células B, um modelo para a fase inicial de formação de sinapse imunológica.

Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

visualizing-actin-microtubule-cytoskeletons-at-b-cell-immune-synapse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

13.6K visualizações.  University of British Columbia. Apresentamos um protocolo para o uso de microscopia STED simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule plus-final em células B que se espalharam em lamelas revestidas com anticorpos contra o receptor de células B, um modelo para a fase inicial de formação de sinapse imunológica.

Vídeo: Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Imunologia e Infecção

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Uma Introdução à Vespas parasitas de<em&gt; Drosophila</em&gt; E Resposta Imune a antiparasitários

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Investigando os efeitos dos probióticos sobre pneumocócica Colonização Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Adesão Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualização do imunológica Synapse por Dual Color Time-fechado Emissão Estimulada Exaustão (STED) Nanoscopia

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of obesity. Therefore, developing an easy and efficient method to document the dynamic changes in adipose tissue is necessary. Here, we describe a modified immunofluorescent approach that efficiently co-stains blood vessels and nerve fibers in adipose tissues. Compared to traditional and recently developed methods, our approach is relatively easy to follow and more efficient in labeling the blood vessels and nerve fibers with higher densities and less background. Moreover, the higher resolution of the images further allows us to accurately measure the area of the vessels, amount of branching, and length of the fibers by open source software. As a demonstration using our method, we show that brown adipose tissue (BAT) contains higher amounts of blood vessels and nerve fibers compared to white adipose tissue (WAT). We further find that among the WATs, subcutaneous WAT (sWAT) has more blood vessels and nerve fibers compared to epididymal WAT (eWAT). Our method thus provides a useful tool for investigating adipose tissue remodeling.

New blood vessel formation and sympathetic innervation play pivotal roles in adipose tissue remodeling. However, there remain technical issues in visualizing and quantitatively measuring adipose tissue. Here we present a protocol to successfully label and quantitatively compare the densities of blood vessels and nerve fibers in different adipose tissues.

Co a coloração dos vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.