Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na pesquisa baseada em proteínas, como anotação de novas proteínas ou domínios proteicos, caracterização de propriedades estruturais e funcionais de proteínas conhecidas, definição de redes de interação proteica ou assinaturas de anticorpos de antígenos em diferentes condições. A principal vantagem desta técnica é que ela é completamente imparcial, de alto rendimento e modular para qualquer tipo de estudo que vai de um único gene até um genoma inteiro. A construção de uma biblioteca de domínios é muito útil para estudos funcionais.
Pode ser transferido para um contexto de exibição de phage e usado para a seleção contra diferentes alvos, como proteínas de ligação ou anticorpos purificados. O acoplamento com NGS permite uma análise extremamente sensível e poderosa. Ao mesmo tempo, as ferramentas web especificamente desenvolvidas dão uma caracterização precisa de todo o domainome e interactome.
Para construir a biblioteca ORF primeiro, sonicar o DNA com pulsos de 30 segundos a 100% de saída. Após a sônicação, carregue a escada e o DNA sonicado em um gel de 1,5%. Em seguida, inicie a unidade de eletroforese a cinco volts por centímetro por 15 minutos.
A eletroforese do gel agarose mostra a presença de mancha de DNA confirmando a sônicação. Isto é comparado com a faixa sólida obtida a partir de um DNA não submetido à sônica. Em seguida, corte a porção de gel com a mancha de DNA fragmentada e purifique usando o kit de extração de gel à base de coluna.
Meça a concentração do DNA purificado no espectrofotômetro UV. Em seguida, siga as instruções do fabricante e trate cinco microgramas da inserção com um microliter de mistura de enzimas de corte rápido. Em seguida, inativar a mistura de enzimas a 70 graus Celsius por 10 minutos.
Para preparar o vetor de filtragem, primeiro digerir cinco microgramas do vetor de clonagem purificado com enzima de restrição EcoRV. Em seguida, carregue os vetores digeridos e não digeridos e o marcador molecular em um gel de 1%agarose. Em seguida, o calor inativa a enzima de restrição a 80 graus Celsius por 20 minutos.
Em seguida, fosforilizar o vetor digerido com cinco unidades de enzima fosfata e 1/10 de volume do tampão fosfates de 10X. Em seguida, incubar a mistura a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, inativar a enzima fosfattase a 65 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, extrair o plasmídeo do gel e purificar o DNA. Em seguida, meça a concentração do DNA no espectrofotômetro UV. Para realizar a reação de ligadura, adicione 400 nanogramas das pastilhas fosforiladas a um micrograma de vetor digestado, tampão de ligase de DNA 10X T4 e liga liga ligase de DNA T4 a um volume final de 100 microliters.
Em seguida, incubar a reação de ligadura a 16 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, o calor inativa a liga ligase a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione 1/10 de volume de três acetato de sódio molar no pH 5.2 e 2,5 volumes de 100% etanol para precipitar o produto de ligadura.
Para precipitar o DNA, misture os reagentes e congele a menos 80 graus Celsius por 20 minutos. Após 20 minutos, centrífuga na velocidade mais alta por 20 minutos a quatro graus Celsius. Depois da centrifugação, expulse o supernasce.
À pelota, adicione 500 microliters de frio 70% de etanol e novamente centrífuga. Descarte o supernatante no final da centrifugação. Uma vez que a pelota é seca ao ar, dissolva o DNA precipitado em 10 microliters de água.
Antes de realizar a eletroporação, organize o número adequado de tubos de microcentrifuuge e cuvettes de eletroporação de 0,1 centímetro no gelo. Em seguida, adicione um microliter do produto de ligadura purificada a 25 microliters das células. Em seguida, pipeta o DNA, mistura celular para a cuvette eletroporação fria e flick o tubo.
Em seguida, limpe a água do exterior da cuvette e coloque na unidade de eletroporação e bata no pulso. Após o fim da eletroporação, adicione rapidamente um mililitro de meio YT líquido 2X sem qualquer antibiótico às células da cuvette. Em seguida, transfira a mistura celular para um tubo de 10 mililitros.
Deixe o tubo em um agitador a 220 revoluções por minuto a 37 graus Celsius por uma hora. Emplaque as diluições da biblioteca em placas de ágar YT de 10 centímetros 2X suplementadas com clororamfenicol, ampicillina e apenas clororamfenicol. Isto é para obter colônias únicas a serem testadas por PCR e realizar a titulação.
Em seguida, emplaque as células competentes transformadas em placas de ágar YT de 15 centímetros 2X suplementadas com clorofenicol e ampicillina. Em seguida, incubar as placas a 30 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, conte as colônias escolhendo a diluição onde são contáveis.
Então calcule o tamanho da biblioteca. O tamanho da biblioteca é calculado da seguinte forma, o número médio de colônia vezes fator de diluição vezes o volume total da biblioteca. O tamanho da biblioteca deve ser da ordem de 10 ao poder de seis clones.
Se a concentração de ampicilina for ideal para realizar mais filtragem, o número de clones reduz para um a 20 do obtido na ausência deste antibiótico. Para testar as colônias positivas, use uma dica para pegar cerca de 15 a 20 colônias individuais. Em seguida, diluir as colônias com 100 microliters de 2X YT médio sem antibióticos.
Em seguida, pcr amplificar 0,5 microliter da cultura como modelo de DNA com polimerase de DNA Taq. Durante o PCR, execute 25 ciclos de amplificações usando temperatura de ressarção de 55 graus Celsius e um tempo de extensão de 40 segundos a 72 graus Celsius. Verifique se o comprimento da pastilha está na faixa esperada de 150 a 750 pares de base.
E que diferentes colônias apresentam diferentes inserções com tamanhos diferentes. Isso indica uma boa preparação da biblioteca em termos de variabilidade. Em seguida, adicione três mililitros de meio YT 2X fresco às placas de 150 milímetros para coletar as bactérias.
Em seguida, colher as bactérias usando um raspador estéril. Depois de misturar bem, adicione 20% de glicerol e deixe em menos 80 graus Celsius em alíquotas para uso futuro. Para uso imediato, execute o kit de extração plasmídeo baseado em coluna para purificar o DNA plasmídeo de uma das alíquotas da biblioteca antes de adicionar glicerol.
Meça a concentração do DNA no espectrofotômetro UV e, em seguida, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius até o uso. Use 2,5 microliters da biblioteca como modelo de DNA para amplificação pcr. Defina as condições do termociclador e inicie a corrida.
Em seguida, use um kit pcr de índice para executar pcr índice. Isso sequenciará as bibliotecas indexadas duplas dentro de executas de Illumina multiplexada. Em seguida, defina as condições do termociclador e inicie a corrida.
Após a purificação com contas AMPure XP, para verificar o tamanho, execute um microliter de uma a 10 diluição da biblioteca final no bioanalíter. Em seguida, quantifique selecionando a região do traço final da biblioteca. Essas representações esquemáticas demonizam que após a clonagem no vetor do filtro P, apenas colônias correspondentes aos ORFs produzem beta-lactamase funcional na presença de antibióticos.
Depois de filtrar uma diminuição no número de clones de 20 vezes é esperado. Com orfs de boa pasta crescendo em concentrações de antibióticos mais altas. Além disso, os fragmentos ORF podem ser facilmente recuperados da biblioteca filtrada.
Uma biblioteca de ORF phagemid é construída para realizar a seleção de exibição de phage contra proteínas-alvo ou anticorpos. Todas as bibliotecas e as saídas obtidas são então profundamente analisadas pelo NGS. O NGS fornece informações completas sobre diversidade de bibliotecas, abundância e mapeamento preciso de cada um dos fragmentos selecionados.
Finalmente, o webtool interactome busca desenvolvido gera leituras de sequenciamento bruto que vão até a lista de domínios putativos com anotações genômicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir e validar uma biblioteca domainome a partir de uma fonte de DNA desejada. E para realizar uma triagem de alto rendimento da biblioteca por sequenciamento de próxima geração.
Otimizamos o sequenciamento das bibliotecas de filtragem ORF com as plataformas Illumina e desenvolvemos um webtool que possibilita a análise desse tipo de dados sem qualquer necessidade de habilidades de programação.
